材料与仪器
核苷酸
SSC 焦磷酸钠 SDS
培养箱 水浴锅
SSC 焦磷酸钠 SDS
培养箱 水浴锅
步骤
1. 制备双份的转印细菌菌落或噬斑的硝酸纤维素滤膜（处理和干烤过）。
2. 在室温下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。
3. 然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至过夜。
2. 在室温下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。
3. 然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至过夜。
4. 在预杂交液中37℃预杂交1 h。
5. 在装有20 ml 以上的SSC杂交液的可封口的杂交袋中可移入多达20张的滤膜。
6. 在毎 个杂交袋中每毫升杂交液加入0.125 ng 至1.0 ng 的每种32P标记的寡核苷酸。
7. 在以下给定的温度条件下寡核苷酸杂交14~48 h。
6. 在毎 个杂交袋中每毫升杂交液加入0.125 ng 至1.0 ng 的每种32P标记的寡核苷酸。
7. 在以下给定的温度条件下寡核苷酸杂交14~48 h。
（1）14 碱基——室温
（2）17 碱基——37℃
（3）20 碱基——42℃
（4）23 碱基——48℃
8. 从杂交袋中取出滤胰，用6×SSC / 0.05%焦磷酸盐洗膜液在室温冼膜3~5次，每次 5~15 min。
9. 再用预热的洗膜液洗膜30 min。预热温度与寡核苷酸片段长度有关。
（1）14 碱基——37℃
（2）17 碱基——48℃
（3）20 碱基——55℃
（4）23 碱基——60℃
9. 再用预热的洗膜液洗膜30 min。预热温度与寡核苷酸片段长度有关。
（1）14 碱基——37℃
（2）17 碱基——48℃
（3）20 碱基——55℃
（4）23 碱基——60℃
10. 如果滤膜高于本底放射性活性，则需要将洗膜温度升高2~3℃，并延长洗膜15~ 30 min。
11. 重新作放射自显影检测。但不得超过以下对应的温度：
（1）14 碱基——41℃
（2）17 碱基——53℃
（3）20 碱基——63℃
（4）23 碱基——70℃
11. 重新作放射自显影检测。但不得超过以下对应的温度：
（1）14 碱基——41℃
（2）17 碱基——53℃
（3）20 碱基——63℃
（4）23 碱基——70℃
12. 用塑料薄膜包裹滤膜，放好，使用增感屏在-70℃对X光片曝光14~72 h，双份滤膜均对X光片曝光，如果在同一位置出现曝光点，那么该位置对应的细菌菌落或噬斑为阳性。
来源：丁香实验
