双重PCR毛细管电泳法

1.总DNA提取

用CTAB法提取植物总DNA.

2.PCR体系及反应条件

双重PCR反应体系：1×buffer,2.5mmol/L MgC12,0.25mmol/L dNTP,primers（0.4 μmol/L ZY1-35S,ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS,ZY4-NOS），1.5units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA100——200ng,总反应体积25μ1.PCR循环参数：95℃预变性3min;95℃ 45s,55℃ 60s,72℃ 45s,共35个循环;72℃延伸5min.

内源基因（Lectin）的PCR 反应体系：1×buffer,2.0mmol/L MgC12,0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L primers.1.0 units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA1O0——200ng,总反应体积25μ1.PCR循环参数为：95℃预变性3min;95℃ 45s,58℃ 60s,72℃ 45s,共35个循环;72℃延伸5min.

3.PCR产物的高效毛细管电泳 在电泳分析前，先将毛细管柱填充1g/L HPMC,再充以含有3.75μmol/L溴乙锭的8g/L HPMC,电泳分离的缓冲溶液为TBE溶液（45mmol/L Tris,45mmol/L boric acid,1 mmol/L EDTA,pH 8.5）。取PCR扩增产物1Oμl加入内标2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl,在-1OkV下电动进样20 s,并在-1OkV下恒压电泳，用543.5nm 波长的激光激发DNA片段与溴乙锭的结合物产生荧光，在590nm波长下检测。电泳温度为20℃。每次电泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液冲洗毛细管5min,再进行下一次检测。pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）Marker用作DNA marker,使用时Maker用适量无菌水稀释。电泳图谱和实验数据用C++语言编制的windows软件进行采集和分析处理。

4.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 将5μl PCR产物与1μl上样buffer混合后上样于30g/L琼脂糖凝胶中（含0.1μg/ml溴化乙锭）。在0.5×TBE电泳缓冲液中，于100V电压下，电泳50min,采用pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）DNA Marker同时电泳，然后用UVI紫外成像分析仪观察结果。

1.内径为100μm的毛细管对DNA 片段标准物质pUC19DNA/Msp I（Hpa Ⅱ）Marker 中的110（111）/147 bp DNA 片段的分离度可达2.91,而且内径为100μm的毛细管柱检测光程较大，因而较内径为50μm和75μm的毛细管柱的检测灵敏度高。采用内径为100μm的毛细管柱，减少其长度至40cm,对110（111）/147bp标准DNA片段的分离度减少至2.13.因此本实验选用50cm×100μm i.d.的毛细管进行电泳分离。

2.随着纤维素质量浓度的增加，对DNA片段的分离能力越好，当胶质量浓度达到8g/L时，110/147bpDNA片段的分离度最大（R=2.91）。继续增加胶的质量浓度，分离度变化不大，但筛分介质的粘度增大，分析时间延长。故本实验选用HPMC为8g/L.

3.不同大小的DNA标准片段的迁移时间均随场强的升高而减小。对于147bp DNA片段，柱效的考察结果显示，在场强为150V/cm——200V/cm 时具有最高理论塔板数2.3×1O0000.当电场强度高于200V/cm时，迁移时间变短，但焦耳热效应也较为显著，从而引起谱带的展宽，在一定程度上降低了柱效，使分离度降低。为了进行快速分离，我们选用在较高的场强200V/cm下进行电泳分析。

1.迁移时间的重现性

DNA片段迁移时间的重现性是基因分析中的重要指标之一。我们对DAN片段迁移时间的重现性进行了考察，在优化的实验条件下，对所用的DNA相对分子质量marker和PCR产物连续分析6次，并在待测试样中加入Sulforhdamine B荧光试剂作为内标物，采用相对迁移时间以消除进样时间和电压的波动对迁移时间的影响。在优化的实验条

件下，对所用的DNA marker分析具有很好的重现性，相对迁移时间的相对标准偏差0.90——1.5.对进口大豆的双重PCR产物重复测定，其中125bp和142bp DNA片段相对迁移时间分别是0.504和0.526,其相对标准偏差为2.O——3.2 .

2.毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳的比较

将阳性抗草甘膦转基因大豆标准、空白对照和进口大豆的双重PCR产物以及阴性非转基因大豆的内源基因PCR产物同时用毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳进行了比较实验，传统的琼脂糖凝胶电泳结果可见，进口大豆和阳性对照的转基因大豆标准均扩增出2个条带，分别为125 bp和142 bp;作为阴性对照的非转基因大豆仅能扩增出内源基因的118 bp条带;用无菌水作模板的空白对照不能扩增出任何条带。比较琼脂糖凝胶电泳与毛细管电泳的结果，两者基本一致。

毛细管电泳采用上万伏的高电压，能更有效地分离差异较小的片段。并能在较短的时间内完成分析。本实验目标DNA片段在15 min内就可被分离，缩短了分析时问。而琼脂糖凝胶电泳分离上述两个片段需要50min.可见，同琼脂糖凝胶电泳相比，毛细管电泳分析速度更快 毛细管电泳所需的样品量少。本实验采用电动进样，进样量约5nl,而琼脂糖凝胶电泳需要5——10μl的上样量 所以用毛细管进行分析，可以大大节约样品用量，适合于痕量分析。

凝胶电泳图谱的条带一般较宽，不利于DNA片段大小的确定。而毛细管电泳柱效高。峰形尖锐，鉴定能力强。本实验采用内标与样品同时电泳，可减少进样时间和电压的波动等造成的实验误差，提高了结果的准确性。根据DNA Marker和样品毛细管电泳图谱，可得DNA片段大小分别为124 bp和145 bp,与测序结果相比较。分别差1 bp和3 hp;图中峰的DNA片段大小为121bp,与文献报道的片段大小相比仅差3 bp.由此可见。用毛细管电泳比用凝胶电泳确定DNA片段大小更为准确。

综上所述，本研究利用双重PCR技术同时扩增抗草甘瞵转基因大豆的3种外澡靶基因，只需一次PCR反应就可以准确鉴定出抗草甘膦大豆 采用激光诱导荧光-毛细管电泳分析PCR产物，较传统琼脂糖凝胶电罚：相比，缩短了分析时间，分析灵敏度显著提高，而且样品用量少 本研究所建立的方法为食品中转基因成分的快速检测提供了一个可靠的分析手段。