双重PCR

相关专题

 

【摘要】 目的建立抗草甘膦转基因大豆的快速检测方法。方法：针对转基因大豆基因组中被导入的35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因，自行设计了两对引物，采用双重PCR同时扩增上述基因，用8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质，在50cm×100μm i．d．涂壁毛细管中，于一10kV电压下用激光诱导荧光-毛细管电泳检测转基因大豆的PCR扩增产物。结果在优化的PCR反应和毛细管电泳条件下，本法可以同时检测出转基因大豆样品中三种外源基因，双重PCR扩增产物经测序证实与原基因序列完全一致，表明本研究设计的引物合理，扩增结果可靠。毛细管电泳进样量仅需5nl，分析时间为24min，迁移时间的相对标准偏差≤3.2。结论本方法较常规琼脂 糖凝胶电泳特异性高，分析时间短，重现性好，检测灵敏，适合于大豆中转基因成分的快速检测。
【关键词】双重PCR ；激光诱导荧光-毛细管电泳；转基因大豆PCR产物检测；羟丙基甲基纤维素
随着转基因农作物的大量种植，其安全性问题也日益受到人们的重视。2002年我国要求对转基因农作物实行标签管理。抗草甘膦(glyphosate)大豆(商品名，roundup ready soybean)是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。目前采用PCR检测转基因大豆的方法大多是采用琼脂糖凝胶电泳 法，首先检测CAMV-35S启动子和NOS终止子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因，操作烦琐、费时。本研究利用双重PCR技术同时扩增上述基因片段，用激光诱导荧光-毛细管电泳高效、快速检测PCR产物，显著提高了检测效率，并使灵敏度大为增加。本方法所需样品量少(nl级)，快速、灵敏和准确，已成功用于实际转基因大豆样品的分析。
1 材料和方法
1．1 仪器与试剂
毛细管电泳-激光诱导荧光检测装置(自行组装)，其中氦氖激光器(543.5nm，JDS Uniphase，USA)参数控制和数据采集用本实验室编制的windows软件控制。石英毛细管(河北永年光导纤维厂)：长50cm和40cm，有效长度为43 cm和32cm，内径分别为50μm、75μm 和100μm，外径为375μm。毛细管柱内表面的聚丙烯酰胺化学键合涂层由本实验室完成。UNO 型PCR仪(德国Biometre公司)，PAC3000型电泳仪(美国BIO RAD公司)，UVI紫外成像分析仪(英国UVI公司)。
阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质(IRMM-410R，Fluka公司)、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供；溴乙锭，羟丙基甲基纤维素(hydroxy-propylmethacrylate，HPMC-4000)，Sulforhdamine B(美国Sigma公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海化学试剂总厂)，乙二胺四乙酸，硼酸(分析纯，成都化学试剂公司)；Taq DNA 聚合酶，dNTPs，pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker(晶美生物工程有限公司)。所用水均为无菌重蒸水。
1．2 寡核苷酸引物
在充分了解抗草甘膦转基因大豆引入的外源基因的基础上，利用Primer premier5．0软件自行设计了两对引物。引物ZY1-35S和ZY2-EPSPS扩增35S和cp4-EPSPS之间的片段，引物ZY3-NOS和ZY4-NOS扩增NOS终止子序列。内源基因Lectin基因引物按文献设计。上述3对引物的序列信息由上海博亚生物技术有限公司合成。
1．3 实验方法
1．3．1 总DNA提取 参照文献，用CTAB法提取植物总DNA。
1．3．2 PCR体系及反应条件 双重PCR反应体系：1×buffer，2.5mmol/L MgC12，0.25mmol/L dNTP，primers(0.4 μmol/L ZY1-35S，ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS，ZY4-NOS)，1.5units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA100～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数：95℃预变性3min；95℃ 45s，55℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
内源基因(Lectin)的PCR 反应体系：1×buffer，2.0mmol/L MgC12，0.2mmol/L dNTP，0.2μmol/L primers。1.0 units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA1O0～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数为：95℃预变性3min；95℃ 45s，58℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
1．3．3 PCR产物的高效毛细管电泳 在电泳分析前，先将毛细管柱填充1g/L HPMC，再充以含有3.75μmol/L溴乙锭的8g/L HPMC，电泳分离的缓冲溶液为TBE溶液(45mmol/L Tris，45mmol/L boric acid，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)。取PCR扩增产物1Oμl加入内标2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl，在-1OkV下电动进样20 s，并在-1OkV下恒压电泳，用543.5nm 波长的激光激发DNA片段与溴乙锭的结合物产生荧光，在590nm波长下检测。电泳温度为20℃。每次电泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液冲洗毛细管5min，再进行下一次检测。pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker用作DNA marker，使用时Maker用适量无菌水稀释。电泳图谱和实验数据用C++语言编制的windows软件进行采集和分析处理。
1．3．4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 将5μl PCR产物与1μl上样buffer混合后上样于30g/L琼脂糖凝胶中(含0.1μg/ml溴化乙锭)。在0.5×TBE电泳缓冲液中，于100V电压下，电泳50min，采用pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)DNA Marker同时电泳，然后用UVI紫外成像分析仪观察结果。
2 结果与讨论
2．1 毛细管电泳条件的优化
2．1．1 毛细管柱长和内径的选择 分别采用不同内径和长度的涂层石英毛细管柱：50cm×50μmi．d．；50 cm × 75μmi．d．；50cm×100μm1．d．；40cmx 100μm i．d．进行试验。实验结果表明，内径为100μm的毛细管对DNA 片段标准物质pUC19DNA/Msp I(Hpa Ⅱ)Marker 中的110(111)/147 bp DNA 片段的分离度可达2.91，而且内径为100μm的毛细管柱检测光程较大，因而较内径为50μm和75μm的毛细管柱的检测灵敏度高。采用内径为100μm的毛细管柱，减少其长度至40cm，对110(111)/147bp标准DNA片段的分离度减少至2.13。因此本实验选用50cm×100μm i．d．的毛细管进行电泳分离。