免疫荧光细胞化学双重染鱼法中，两种一抗在混合稀释时怎么保证最终浓度？

进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。

此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。

需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验，从中发现最佳的稀释比例。如果说明书没有推荐稀释比例，仅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的预实验来摸索最佳的比例了。

两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。