双重PCR

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【摘要】 目的建立抗草甘膦转基因大豆的快速检测方法。方法：针对转基因大豆基因组中被导入的35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因，自行设计了两对引物，采用双重PCR同时扩增上述基因，用8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质，在50cm×100μm i．d．涂壁毛细管中，于一10kV电压下用激光诱导荧光-毛细管电泳检测转基因大豆的PCR扩增产物。结果在优化的PCR反应和毛细管电泳条件下，本法可以同时检测出转基因大豆样品中三种外源基因，双重PCR扩增产物经测序证实与原基因序列完全一致，表明本研究设计的引物合理，扩增结果可靠。毛细管电泳进样量仅需5nl，分析时间为24min，迁移时间的相对标准偏差≤3.2。结论本方法较常规琼脂 糖凝胶电泳特异性高，分析时间短，重现性好，检测灵敏，适合于大豆中转基因成分的快速检测。
【关键词】双重PCR ；激光诱导荧光-毛细管电泳；转基因大豆PCR产物检测；羟丙基甲基纤维素
随着转基因农作物的大量种植，其安全性问题也日益受到人们的重视。2002年我国要求对转基因农作物实行标签管理。抗草甘膦(glyphosate)大豆(商品名，roundup ready soybean)是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。目前采用PCR检测转基因大豆的方法大多是采用琼脂 糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动子和NOS终止子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因，操作烦琐、费时。本研究利用双重PCR技术同时扩增上述基因片段，用激光诱导荧光-毛细管电泳高效、快速检测PCR产物，显著提高了检测效率，并使灵敏度大为增加。本方法所需样品量少(nl级)，快速、灵敏和准确，已成功用于实际转基因大豆样品的分析。
1 材料和方法
1．1 仪器与试剂
毛细管电泳-激光诱导荧光检测装置(自行组装)，其中氦氖激光器(543.5nm，JDS Uniphase，USA)参数控制和数据采集用本实验室编制的windows软件 控制。石英毛细管(河北永年光导纤维厂)：长50cm和40cm，有效长度为43 cm和32cm，内径分别为50μm、75μm 和100μm，外径为375μm。毛细管柱内表面的聚丙烯酰胺化学键合涂层由本实验室完成。UNO 型PCR仪(德国Biometre公司)，PAC3000型电泳仪(美国BIO RAD公司)，UVI紫外成像分析仪(英国UVI公司)。
阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质(IRMM-410R，Fluka公司)、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所 提供；溴乙锭，羟丙基甲基纤维素(hydroxy-propylmethacrylate，HPMC-4000)，Sulforhdamine B(美国Sigma公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海化学试剂总厂)，乙二胺四乙酸，硼酸(分析纯，成都化学试剂公司)；Taq DNA 聚合酶，dNTPs，pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker(晶美生物工程有限公司)。所用水均为无菌重蒸水。
1．2 寡核苷酸引物
在充分了解抗草甘膦转基因大豆引入的外源基因的基础上，利用Primer premier5．0软件自行设计了两对引物。引物ZY1-35S和ZY2-EPSPS扩增35S和cp4-EPSPS之间的片段，引物ZY3-NOS和ZY4-NOS扩增NOS终止子序列。内源基因Lectin基因引物按文献设计。上述3对引物的序列信息由上海博亚生物技术有限公司合成。
1．3 实验方法
1．3．1 总DNA提取 参照文献，用CTAB法提取植物总DNA。
1．3．2 PCR体系及反应条件 双重PCR反应体系：1×buffer，2.5mmol/L MgC12，0.25mmol/L dNTP，primers(0.4 μmol/L ZY1-35S，ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS，ZY4-NOS)，1.5units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA100～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数：95℃预变性3min；95℃ 45s，55℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
内源基因(Lectin)的PCR 反应体系：1×buffer，2.0mmol/L MgC12，0.2mmol/L dNTP，0.2μmol/L primers。1.0 units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA1O0～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数为：95℃预变性3min；95℃ 45s，58℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
1．3．3 PCR产物的高效毛细管电泳 在电泳分析前，先将毛细管柱填充1g/L HPMC，再充以含有3.75μmol/L溴乙锭的8g/L HPMC，电泳分离的缓冲溶液为TBE溶液(45mmol/L Tris，45mmol/L boric acid，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)。取PCR扩增产物1Oμl加入内标2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl，在-1OkV下电动进样20 s，并在-1OkV下恒压电泳，用543.5nm 波长的激光激发DNA片段与溴乙锭的结合物产生荧光，在590nm波长下检测。电泳温度为20℃。每次电泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液冲洗毛细管5min，再进行下一次检测。pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker用作DNA marker，使用时Maker用适量无菌水稀释。电泳图谱和实验数据用C++语言编制的windows软件进行采集和分析处理。
1．3．4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 将5μl PCR产物与1μl上样buffer混合后上样于30g/L琼脂糖凝胶中(含0.1μg/ml溴化乙锭)。在0.5×TBE电泳缓冲液中，于100V电压下，电泳50min，采用pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)DNA Marker同时电泳，然后用UVI紫外成像分析仪观察结果。
2 结果与讨论
2．1 毛细管电泳条件的优化
2．1．1 毛细管柱长和内径的选择 分别采用不同内径和长度的涂层石英毛细管柱：50cm×50μmi．d．；50 cm × 75μmi．d．；50cm×100μm1．d．；40cmx 100μm i．d．进行试验。实验结果表明，内径为100μm的毛细管对DNA 片段标准物质pUC19DNA/Msp I(Hpa Ⅱ)Marker 中的110(111)/147 bp DNA 片段的分离度可达2.91，而且内径为100μm的毛细管柱检测光程较大，因而较内径为50μm和75μm的毛细管柱的检测灵敏度高。采用内径为100μm的毛细管柱，减少其长度至40cm，对110(111)/147bp标准DNA片段的分离度减少至2.13。因此本实验选用50cm×100μm i．d．的毛细管进行电泳分离。