双重PCR-毛细管电泳法快速检测大豆中转基因成分

【摘要】 目的建立抗草甘膦转基因大豆的快速检测方法。方法：针对转基因大豆基因组中被导入的35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因，自行设计了两对引物，采用双重PCR同时扩增上述基因，用8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质，在50cm×100μm i．d．涂壁毛细管中，于一10kV电压下用激光诱导荧光-毛细管电泳检测转基因大豆的PCR扩增产物。结果在优化的PCR反应和毛细管电泳条件下，本法可以同时检测出转基因大豆样品中三种外源基因，双重PCR扩增产物经测序证实与原基因序列完全一致，表明本研究设计的引物合理，扩增结果可靠。毛细管电泳进样量仅需5nl，分析时间为24min，迁移时间的相对标准偏差≤3.2。结论本方法较常规琼脂糖凝胶电泳特异性高，分析时间短，重现性好，检测灵敏，适合于大豆中转基因成分的快速检测。
【关键词】双重PCR；激光诱导荧光-毛细管电泳；转基因大豆PCR产物检测；羟丙基甲基纤维素
随着转基因农作物的大量种植，其安全性问题也日益受到人们的重视。2002年我国要求对转基因农作物实行标签管理。抗草甘膦(glyphosate)大豆(商品名，roundup ready soybean)是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。目前采用PCR检测转基因大豆的方法大多是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动子和NOS终止子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因，操作烦琐、费时。本研究利用双重PCR技术同时扩增上述基因片段，用激光诱导荧光-毛细管电泳高效、快速检测PCR产物，显著提高了检测效率，并使灵敏度大为增加。本方法所需样品量少(nl级)，快速、灵敏和准确，已成功用于实际转基因大豆样品的分析。
1 材料和方法
1．1 仪器与试剂
毛细管电泳-激光诱导荧光检测装置(自行组装)，其中氦氖激光器(543.5nm，JDS Uniphase，USA)参数控制和数据采集用本实验室编制的windows软件控制。石英毛细管(河北永年光导纤维厂)：长50cm和40cm，有效长度为43 cm和32cm，内径分别为50μm、75μm 和100μm，外径为375μm。毛细管柱内表面的聚丙烯酰胺化学键合涂层由本实验室完成。UNO 型PCR仪(德国Biometre公司)，PAC3000型电泳仪(美国BIO RAD公司)，UVI紫外成像分析仪(英国UVI公司)。
阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质(IRMM-410R，Fluka公司)、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供；溴乙锭，羟丙基甲基纤维素(hydroxy-propylmethacrylate，HPMC-4000)，Sulforhdamine B(美国Sigma公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海化学试剂总厂)，乙二胺四乙酸，硼酸(分析纯，成都化学试剂公司)；Taq DNA 聚合酶，dNTPs，pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker(晶美生物工程有限公司)。所用水均为无菌重蒸水。
1．2 寡核苷酸引物
在充分了解抗草甘膦转基因大豆引入的外源基因的基础上，利用Primer premier5．0软件自行设计了两对引物。引物ZY1-35S和ZY2-EPSPS扩增35S和cp4-EPSPS之间的片段，引物ZY3-NOS和ZY4-NOS扩增NOS终止子序列。内源基因Lectin基因引物按文献设计。上述3对引物的序列信息由上海博亚生物技术有限公司合成。
1．3 实验方法
1．3．1 总DNA提取 参照文献，用CTAB法提取植物总DNA。
1．3．2 PCR体系及反应条件 双重PCR反应体系：1×buffer，2.5mmol/L MgC12，0.25mmol/L dNTP，primers(0.4 μmol/L ZY1-35S，ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS，ZY4-NOS)，1.5units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA100～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数：95℃预变性3min；95℃ 45s，55℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
内源基因(Lectin)的PCR 反应体系：1×buffer，2.0mmol/L MgC12，0.2mmol/L dNTP，0.2μmol/L primers。1.0 units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA1O0～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数为：95℃预变性3min；95℃ 45s，58℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
1．3．3 PCR产物的高效毛细管电泳 在电泳分析前，先将毛细管柱填充1g/L HPMC，再充以含有3.75μmol/L溴乙锭的8g/L HPMC，电泳分离的缓冲溶液为TBE溶液(45mmol/L Tris，45mmol/L boric acid，1 mmol/L EDTA，pH 8.5)。取PCR扩增产物1Oμl加入内标2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl，在-1OkV下电动进样20 s，并在-1OkV下恒压电泳，用543.5nm 波长的激光激发DNA片段与溴乙锭的结合物产生荧光，在590nm波长下检测。电泳温度为20℃。每次电泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液冲洗毛细管5min，再进行下一次检测。pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker用作DNA marker，使用时Maker用适量无菌水稀释。电泳图谱和实验数据用C++语言编制的windows软件进行采集和分析处理。
1．3．4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 将5μl PCR产物与1μl上样buffer混合后上样于30g/L琼脂糖凝胶中(含0.1μg/ml溴化乙锭)。在0.5×TBE电泳缓冲液中，于100V电压下，电泳50min，采用pUC19DNA/Msp I(HpaⅡ)DNA Marker同时电泳，然后用UVI紫外成像分析仪观察结果。
2 结果与讨论
2．1 毛细管电泳条件的优化
2．1．1 毛细管柱长和内径的选择 分别采用不同内径和长度的涂层石英毛细管柱：50cm×50μmi．d．；50 cm × 75μmi．d．；50cm×100μm1．d．；40cmx 100μm i．d．进行试验。实验结果表明，内径为100μm的毛细管对DNA 片段标准物质pUC19DNA/Msp I(Hpa Ⅱ)Marker 中的110(111)/147 bp DNA 片段的分离度可达2.91，而且内径为100μm的毛细管柱检测光程较大，因而较内径为50μm和75μm的毛细管柱的检测灵敏度高。采用内径为100μm的毛细管柱，减少其长度至40cm，对110(111)/147bp标准DNA片段的分离度减少至2.13。因此本实验选用50cm×100μm i．d．的毛细管进行电泳分离。

2．1．2 筛分介质的选择 筛分介质的选择是无胶筛分毛细管电泳中遇到的重要问题。在毛细管电泳分离DNA时，以水溶性高分子化合物如纤维素及其衍生物为筛分介质使用较多。本研究采用HPMC-4000作为筛分介质。由于本实验研究的DNA片段大小在118～142bp之间，所以我们试验了不同质量浓度的HPMC-4000溶液对DNAMarkerll0(111)/147bpDNA片段分离效果的影响。研究结果表明，随着纤维素质量浓度的增加，对DNA片段的分离能力越好，当胶质量浓度达到8g/L时，110/147bpDNA片段的分离度最大(R=2.91)。继续增加胶的质量浓度，分离度变化不大，但筛分介质的粘度增大，分析时间延长。故本实验选用HPMC为8g/L。
2．1．3 分离电压的影响 由于毛细管电泳能在高压下进行，而具有很高的分离效能。改变分离电压，电场强度随之改变，从而影响DNA片段的分离。分别在100V/cm、150V/cm、200V/cm、250V/cm和300V/cm场强条件下对DNA Marker的分离进行了考察。如表2显示，不同大小的DNA标准片段的迁移时间均随场强的升高而减小。对于147bp DNA片段，柱效的考察结果显示，在场强为150V/cm～200V/cm 时具有最高理论塔板数2.3×1O0000。当电场强度高于200V/cm时，迁移时间变短，但焦耳热效应也较为显著，从而引起谱带的展宽，在一定程度上降低了柱效，使分离度降低。为了进行快速分离，我们选用在较高的场强200V/cm下进行电泳分析。
在优化的毛细管电泳条件下DNA相对分子质量标准物质pUCl9DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker的毛细管电泳图谱。
2．2 双重PCR扩增条件的优化
引物对ZY1-35S，ZY2-EPSPS用于扩增转基因大豆导入的外源基因中35S启动子和抗草甘膦基因，扩增产物的DNA片段为142 bp；引物对ZY1-NOS，ZY2-NOS用于扩增转基因大豆导入的外源基因中的NOS终止子，扩增产物为125 bp。引物对Lectinl，Lectin2针对大豆凝集素基因，其扩增产物的DNA片段为118 bp，用作内参照，确证提取的大豆核酸是否适合PCR扩增，排除假阴性。在优化的分离条件下，PCR产物可直接进行毛细管电泳分离。用无菌重蒸水代替DNA模板作为空白对照，双重PCR同时扩增外源基因经毛细管电泳后无任何峰出现，说明PCR反应无外来物质的干扰。而转基因大豆标准物质和进口大豆的双重PCR扩增产物经毛细管电泳后均出现两个峰，电泳峰2为CAMV-35S启动子-EPSPS抗草甘膦基因的PCR产物，电泳峰3为NOS终止子的PCR产物。对转基因大豆的双重PCR扩增产物进行测序分析，具体序列信息详见GenBank AY564226、AY578916。测序结果显示，该扩增产物的序列与原基因序列完全一致，表明本实验引物设计合理，扩增结果可靠。双重PCR扩增非转基因大豆的外源基因经毛细管电泳没有峰出现而引物对Lectin 1，Lectin2的扩增产物电泳后出现一个峰，为大豆的内源基因PCR产物(118 bp)。由此可见，本方法所设计的引物和优化的扩增条件对转基因和非转基因大豆具有很好的特异性，能够可靠地鉴定抗草甘膦转基因大豆。
2．3 迁移时间的重现性
DNA片段迁移时间的重现性是基因分析中的重要指标之一。我们对DAN片段迁移时间的重现性进行了考察，在优化的实验条件下，对所用的DNA相对分子质量marker和PCR产物连续分析6次，并在待测试样中加入Sulforhdamine B荧光试剂作为内标物，采用相对迁移时间以消除进样时间和电压的波动对迁移时间的影响。在优化的实验条
件下，对所用的DNA marker分析具有很好的重现性，相对迁移时间的相对标准偏差0.90～1.5。对进口大豆的双重PCR产物重复测定，其中125bp和142bp DNA片段相对迁移时间分别是0.504和0.526，其相对标准偏差为2.O～3.2 。
2．4 毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳的比较 将阳性抗草甘膦转基因大豆标准、空白对照和进口大豆的双重PCR产物以及阴性非转基因大豆的内源基因PCR产物同时用毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳进行了比较实验，传统的琼脂糖凝胶电泳结果可见，进口大豆和阳性对照的转基因大豆标准均扩增出2个条带，分别为125 bp和142 bp；作为阴性对照的非转基因大豆仅能扩增出内源基因的118 bp条带；用无菌水作模板的空白对照不能扩增出任何条带。比较琼脂糖凝胶电泳与毛细管电泳的结果，两者基本一致。
毛细管电泳采用上万伏的高电压，能更有效地分离差异较小的片段．并能在较短的时间内完成分析。本实验目标DNA片段在15 min内就可被分离，缩短了分析时问。而琼脂糖凝胶电泳分离上述两个片段需要50min。可见，同琼脂糖凝胶电泳相比，毛细管电泳分析速度更快 毛细管电泳所需的样品量少。本实验采用电动进样，进样量约5nl，而琼脂糖凝胶电泳需要5～10μl的上样量 所以用毛细管进行分析，可以大大节约样品用量，适合于痕量分析。
凝胶电泳图谱的条带一般较宽，不利于DNA片段大小的确定。而毛细管电泳柱效高．峰形尖锐，鉴定能力强。本实验采用内标与样品同时电泳，可减少进样时间和电压的波动等造成的实验误差，提高了结果的准确性.根据DNA Marker和样品毛细管电泳图谱，可得DNA片段大小分别为124 bp和145 bp，与测序结果相比较．分别差1 bp和3 hp；图中峰的DNA片段大小为121bp，与文献报道的片段大小相比仅差3 bp。由此可见．用毛细管电泳比用凝胶电泳确定DNA片段大小更为准确。
综上所述，本研究利用双重PCR技术同时扩增抗草甘瞵转基因大豆的3种外澡靶基因，只需一次PCR反应就可以准确鉴定出抗草甘膦大豆 采用激光诱导荧光-毛细管电泳分析PCR产物，较传统琼脂糖凝胶电罚：相比，缩短了分析时间，分析灵敏度显著提高，而且样品用量少 本研究所建立的方法为食品中转基因成分的快速检测提供了一个可靠的分析手段。