DNA定点突变实验

一、引物设计

每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。

 

二、反应

1.  使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。

 

2.  反应体系：

 

（1）10x pyrobest Buffer： 5 ul

 

（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul

 

（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul

 

（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul

 

（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul

 

（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul

 

（7）加无菌蒸馏水至50ul.

 

三、产物沉淀纯化

1.  加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。

2.  70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。
 

四、DpnI酶切

1.  酶切体系

（1）Buffer ：2 ul

 

（2）BSA（100x）：0.2 ul

 

（3）DNA ：x ul

 

（4）DpnI：0.5 ul

 

（5）加无菌去离子水至 20 ul。

 

2.  30℃酶切 1~4 h。

3.  65℃水浴15min 终止反应。

 

五、转化

将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

 

六、测序验证

1.  引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

2.  Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange®、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。

3.  DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

4.  实验板长出来的菌有两种可能，一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体），不过这两种菌长得一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的。

5.  做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。如果两者都拿去DNPI处理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

1.  实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：

 

第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。

 

大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。

 

第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。

 

对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。

 

对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。

 

接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

 

2.  大家马上就会想到几个问题了：

 

第一：引物怎么设计呢？

 

第二：模板怎么去掉呢？

 

第三：怎么拿到质粒呢？

 

对于第一个问题：怎么设计引物？

 

我只能讲一些原则，并举一些例子。

 

引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：

 

不过这种突变引物要加上一个原则：

 

一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。

 

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。

 

这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：

 

X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960

 

现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924

 

~undefined*********************************************_************~K~Hdiv~M~2~1~Kdiv~M~2~1~0 

|------>deletion

 

X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020

 

现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984

 

~undefined**********************************************************~K~Hdiv~M~2~1~Kdiv~M~2~1~0 

（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）

 

我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。

 

故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG

 

并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG

 

其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。

 

引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。

 

这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物

 

对于第二个问题：

 

怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。

 

关于第三个问题：

 

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。

 

下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：

 

1、 根据现有基因设计引物；

 

2、 合成引物并准备好模板；

 

3、 PCR，

 

4、 DpnI处理酶切产物；

 

5、 转化酶切产物；

 

6、 筛选 阳性克隆；

 

7、 送测序并测全长。