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定点突变遇到困难

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1900
请教高手,我做一蛋白的定点突变,采用overlap的方式,但当我把短片段扩出来后,就怎么也不能将全片段(1.58Kb)扩出来,我不知道是不是引物的问题,请大家帮我看看
这是整个CD序列:
ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGAGGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCTTCTCCTACGAGCGGCTGTCTCTGAAGCGGGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCGCTGGCTGTGCTGCTGTGTGTGTGCACGGAGCGTGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCTTACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATGCTGGGGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAGATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGTGAGTTCTACGACCGAGCTGGGCACGACATTCGAGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGGGGGGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCTTCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCGGGCCGAGATGGGCGGCCGCGGCTGAAGACCATGAAGGGTGGGACGGGCAATGGGCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGGGAGACTGACGAGACGTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCGTGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGGCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGCAAAGCTGTTACCATGGACTCGGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGACGCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGGGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGTACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAGAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGCAACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAAGTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGGGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGACCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGGCTCCTGGGTGACATCGGGGGCCAGATGGGGCTGTTCATCGGGGCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGACGAGGAAAATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACCCGTGCGAGAGCCTTCGGGGCCACCCTGCCGGGATGACATACGCTGCCAACATCCTACCTCACCATCCGGCCCGAGGCACGTTCGAGGACTTTACCTGCTG
这是扩前片段的上、下游引物:
P11: 5-GCCTCGAGATG GAA CTG AAG GCC-3
P12:5-GAA GGA CGT TCC GCC AGT CTC CCC-3
这是扩后片段的上、下游引物:
P21: 5-ACGTCCTTCCAAGCAGGCATCC-3
P22: 5-GCAAGCTTTCA GCA GGT AAA GTCCTC G-3
扩出两段小片段后,再用这两小片段为模板,用P11和P22为上、下游引物,进行PCR扩增,但扩不出1.58Kb的全片段了,而是500多bp的带和引物二聚体的带。不知道哪里出问题了,请高手指点!谢谢!
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