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科研学霸天团,48小时有问必答
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什么是核酸适配体?SELEX技术制备核酸适配体的原理是什么?
txs900416
核酸适配体(Aptamer)是一段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。SELEX技术即指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by
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为什么染色质免疫共沉淀的时候,抗体加多了反而免疫效率低了?
府宅
抗体过多,会使假阳性信号增多,影响免疫效率
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wb如何才能把内参蛋白条带跑直?
dxy_gwrp7ndq
1.分离好蛋白上清,在加Loading buffer,ddH2O前药先把金属浴仪器打开,使其尽快达到预定温度。然后快速于每个蛋白样品中加入LB和水。这样可防止蛋白的继续降解。2.蛋白上样时,样品要混匀,特别是做CO-IP实验蛋白样品中含珠子的一定要充分混匀3.药物或其他外界因素:使用影响围观蛋白的药物作用细胞,如长春新碱、紫杉醇等不要用tubulin蛋白;在做缺氧相关实验时不要用GAPDH;有些药
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问
chip-seq实验相关问题
txs900416
单克隆或多克隆抗体都可用于ChIP实验。 单克隆抗体只识别目的蛋白的单个表位,因此有非常高的特异性,和较低的非特异结合、较低的背景和杂带,而且生产批次稳定。但是单克隆抗体识别的表位可能位于蛋白与DNA结合位置或因联过程而被掩蔽,这种情况就导致抗体不能结合该表位导致实验失败,但这种情况通常极少出现。 多克隆抗体识别多个抗原表位,可以更有效地结合目的蛋白、成功率更高;但非特异结合也增加,导致杂带更多。
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elisa实验有哪些步骤需要特别注意的呢?
dxy_gwrp7ndq
1.要注意在包被时:①板孔的选择:ELISA级别的微孔板②抗体选择:选择支持ELISA实验的抗体,根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度③包被缓冲液:pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液④包被温度:2-8 ℃过夜包被或室温(37℃)包被2h⑤包被浓度:包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。2、注意在封闭时:①包被之后一定要立即封闭(封闭非特异性
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问
请问elisa实验中37℃孵育时,是放水浴锅还是恒温箱比较合适?
txs900416
水浴锅和恒温箱的区别在于湿度不同,理论上水浴锅可以防止液体挥发,但存在的问题是水浴不容易放稳,建议将elisa酶标条放湿盒中再放恒温箱以减少挥发
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纳米抗体作为酶联免疫实验试剂盒的潜力?
dxywode
和传统抗体相比,纳米抗体分子量小,结构简单。而得益于分子量小的优势,纳米抗体制备更进一步具有多个特征,使得纳米抗体在新药物发现方面表现出巨大的潜力:高耐热性和稳定性;高抗原结合性;较强的组织穿透力;高水溶性、高表达性。因纳米抗体分子量小、结构简单,由单一的基因编码,所以它很容易在微生物中合成,能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达,而且其相对价格低廉、可进行大规模生产,易于普及和应用。
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问
组合应用免疫抑制剂+人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)能否治愈狂犬病?
dxywode
这些只是实验结果,还只是很小的研究进展,毕竟距离应用到人类临床研究,犬类的动物实验都可能与小鼠具有不同的结果。但毕竟指示了狂犬治疗的可能性,推动了一个方向的发展。
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问
人体免疫球蛋白是怎么样形成过程,跟强化?
txs900416
B细胞在接受抗原刺激后迅速分化增殖,除一部分分化记忆细胞外,其余分化为浆细胞。浆细胞在内质网和多聚糖体均显著增加,大量合成Ig分子。抗体主要通过类别转化强化,可转换成稳定、半衰期长的ig
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小鼠外周血少量免疫细胞怎么测定?
txs900416
小鼠外周血少,全取后要尽量用淋巴细胞分离液分离再做进一步检测,又损失了很多细胞,还要进行pma/ion/bfa联合刺激,细胞又会损失。建议取小鼠脾脏进行实验,可获得较多的淋巴细胞。
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免疫组化的切片相关问题
府宅
冰冻切片相比较于石蜡切片简单易行,一般进行固定脱水后,固定于包埋剂就可以在冰冻切片机进行切片。有些新鲜标本可以直接取材后,冷冻托涂包埋剂后置于冷冻托上速冻,冻好后立即切片。冰冻切片最重要的是防止样品中冰晶的出现,一般可以通过速冻的方法使组织温度骤降,减少样品内冰晶的形成。也可以将组织置于20%~30%蔗糖溶液1~3天,利用高渗吸收组织中水分,减少组织含水量。
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酶联免疫吸附试验相关问题
dxy_gwrp7ndq
1、要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好,滴瓶不易控制加液量不准,造成显色不统一,判断错误。2、显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下,加显色系统后要避光反应,显色液量不能过多,以免显色过强。3、试剂的影响因数:应选用有国家批准文号,质量靠得住的产品,不能图便宜,忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内,在使用时先平衡至室温,不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂
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chip-seq实验相关问题
dxy_gwrp7ndq
ChIP实验中的抗体对于特异性、亲和力、效价都具有较高要求,能够成功用于WB、IHC等实验的抗体并不确保能成功运用于ChIP,因此需要选用经过ChIP验证的商品化抗体,这类抗体常会标明ChIP grade。关于单抗和多抗。单抗具有特异性优势,但风险在于其识别表位可能恰好被掩蔽(DNA或交联环节),而多抗可识别多个表位可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点,应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。
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宫颈上皮内瘤变CIN2,免疫组化p16、ki67(-)应该诊断为?
dxy_gwrp7ndq
P16和Ki67的阳性程度,判定方法是这两者阳性占宫颈上皮的多少,如果P16和Ki67阳性都超过鳞状上皮2/3层,那么就是高级别病变,若是两者只是阳性不超过1/3就是低级别,要是都是基底阳性就是正常的。宫颈上皮内瘤变CIN2,免疫组化p16、ki67(-),就可以诊断为低级别宫颈上皮内瘤变
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请问如何更好的封闭非特异性蛋白?但是对目标蛋白没有影响。跑出来的条带总是有杂带或者背景不干净,除了封闭,还应该优化哪些步骤?
府宅
Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议:目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。上样量过高,太敏感——适当减少上样量。一抗特
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请问如何对条带的结果定量能更贴近真是的表达量?定量时,不同泳道的蛋白需要用同样大小的圈吗?
dxywode
不能严格定量,只能互相比较。 无论什么染色法,条带亮度会随着染液多少及染色时间的不同而变化,无法严格定量。 page的作用更多的是看目的条带的大小,以及两个样品中相同蛋白互相比较多少。不能精确算出是多少ug或ng。
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免疫组化有什么意义,准确性如何?
梁总的贴身医生
①恶性肿瘤的诊断和鉴别。②确定转移性恶性肿瘤的原发部位,有些肿瘤在发现的时候已经有转移了,而我们却发现的是转移部位,而不是原发部位,这时候免疫组化就可以帮助我们找到肿瘤的原发部位。③对某类肿瘤进行病理分型。④明确软组织(如肌肉、韧带、骨膜、脂肪等)肿瘤的正确组织学分类,明确软组织的诊断,因其种类多、组织形态相像,有时难以区分其组织来源,应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的。⑤
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问
请问为什么同一条带,每次涂显影液会出来趋势不一样的结果?怎么样涂才能使结果更准确?
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冰冻切片做免疫荧光总是脱片怎么办?
txs900416
可以试一试把你切完的片子,晾干,用APES再浸泡一下子,再晾干,水洗三次,接着做,看一看能否不掉片子,此外也考虑一下OCT的原因,调整合适的温度
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小鼠效应T和记忆T cell
txs900416
效应T细胞和记忆T细胞一般采用cd62L和cd45ra区分,可加ccr7作为区别。通常将t细胞分为初始细胞记忆细胞(memory,tm)和效应细胞(teff)等亚群,其中tm又分为干细胞型(stem cell,tscm)、中央型(central,tcm)和效应型(effector,tem)等组份。这些cd8t细胞亚群及组份具有不同的表型标志,其中tscm和tcm同时表达趋化因子受体ccr7、黏附分
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