请问如何更好的封闭非特异性蛋白？但是对目标蛋白没有影响。跑出来的条带总是有杂带或者背景不干净，除了封闭，还应该优化哪些步骤？

Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议：

1. 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
   查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
2. 目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
3. 样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
4. 上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
5. 一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
6. 一抗不纯——纯化抗体
7. 一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。

1. Western blot结果中的背景为什么较高?

可能的原因及建议：

膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。

膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。

检测时曝光时间过长——减少曝光时间。