elisa实验有哪些步骤需要特别注意的呢？

1.要注意在包被时：

①板孔的选择：ELISA级别的微孔板

②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度

③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液

④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h

⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。

2、注意在封闭时：

①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）

②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）

1.注意加样及孵育时

①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm；

③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示；

④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性

⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染

2.注意显色和终止时

①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明

②显色底物需现配现用，避免污染

③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可

ELISA操作注意事项如下:(1)加样:在ELISA中除了包被外,一般需进行4~5次加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性,例如规定为加样1滴。此时应该使用相同口径的滴管,保持准确的加样姿势,使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出现气泡。(2)孵育:在ELISA中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加结合物后,此时反应的温度和时间应按规定的要求,保温容器最好是水浴箱,可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发,板上应加盖,或将平板放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的,传热容易。如用保温箱,空湿盒应预先放在其中,以平衡温度,这一步骤在室温较低时更为重要。加入底物后,反应时间和温度通常不做严格要求。(3)洗涤:洗涤在ELISA过程中虽不是反应步骤,但却是决定成败的关键。洗涤的目的是洗去反应中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。(4)显色及终止反应:显色是酶促反应,应按规定的温度和时间损伤,用酸终止。(5)结果判断:用比色计测定结果,准确性决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。