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科研学霸天团，48小时有问必答

问为什么 WB 有荧光，但曝光失败？

yunzhongmanbu555

我觉得很可能是显影液的问题。新鲜的显影液应该是淡黄透明，如果变成酱油色就尽量别用了。以前我就遇到过这种情况，一换显影液，马上就可以显出了。

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问为什么做的 Western 最后都没有显出影啊？

wuhao88

在两个实验室遇到过ECL试剂盒出问题，第一次是前人用试剂盒时吸取液体没有换枪头，试剂盒污染；第二次是师兄用下来的试剂盒，开封日期已经2年，最后验证是试剂盒失效，换了试剂盒之后就曝出很漂亮的条带，浪费了我半个月时间。我遇到同样的问题是从头找起的：先用考马斯亮蓝染胶看看胶上有没有蛋白，排除蛋白被降解，如果没有问题，再用考马斯亮蓝染转膜后的膜，可以看到膜上是不是有蛋白，如果还没有问题，就要注意二抗是不是

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问为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致？

dxymuchong

我可以这么理解吗：内参稳定说明上样量稳定（应该大致是一样的），所以不存在什么上样量不一样的问题；出现这样的结果，问题出在每一步都有一定的可能性，比如电泳，转膜，敷抗体，显色等等。但据我所知，WB最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。我的建议是你再认认真真，仔仔细细做几遍，很可能重复性就做出来了。只是个人观点。

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问为什么用 ELISA 试剂盒检测样品显色无差异？

jm晶美生物

显色弱灵敏度低。在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因： 1.产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。 2.试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。3. 少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。4. 洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。5.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。6.洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过

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问为什么 Western Blot 的条带向两边扩散？

larixa

你的胶是失败的，胶的比例有无问题，微波炉加热是否充分，趁热倒胶时是否均匀，冷却凝结时是否静置，冷却时间是否足够。都可能出现小问题。从你的叙述来看，你的胶可能不止一处存在问题。先不要浪费你的样品，先研究一下怎样做出能用的凝胶。

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问为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

我是金博士

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才

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问做 WB，一抗和 marker 怎样选取？

xzmcjxj

个人觉得一抗的话是abcam，cell signaling technology,santa cruz,bioworld这几家公司的不错，也比较常用，购买一抗的时候要注意它的试用范围，比如说使用的物种，主要就是H\M\R，指的是人、小鼠和大鼠，还有就是它适合做哪些实验，最常规的就是WB\IF\IMH等。而marker的话就是要根据自己的目的蛋白的大小来决定了，一般选接近的，如果分子量比较小的话就

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问做免疫沉降能否使用不同公司生产的抗体？

changhao6787

能不能做IP要看抗体说明书，有适用范围；磷酸化和非磷酸化MW差不了这么多，基本是一致的，你可以看看sigma是不是对于截短的蛋白跑wb的，具体你目标蛋白的分子量（MW）你可以在NCBI上或是文献途径确定一下，没有要求鼻血用一种公司的抗体进行试验。

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问请问如何提取 IgAN 患者血清中的免疫复合物？

云天昊

离子交换层析法提取IgG　　常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAE-Sephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAE-SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG。

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问请问性价比较高的蛋白裂解液推荐什么品牌？

萧莣苼

蛋白裂解液，现在差异不会太大，进口有CST，abcam等等，国产有碧云天，生工，百奇生物等等，不同蛋白裂解液可能不一样。

1 回答631 围观

问血液保存

twoicedragon

将全血离心后取血清-80度保存,全血冻存的话，红细胞会裂解，血清会被红细胞液污染。

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问ECL 试剂盒荧光特别弱怎么办？

hbzwwxclxq

一般ECL发光液我们实验室是在用之前从4度取出配好需要的量，然后马上放回4度冰箱，很多人是拿出来一直常温下放着等曝完光再放回冰箱，这样可能就会影响到效果哦，还有就是注意有效期吧。。。。

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问原核表达目的蛋白分子量小于GST标签蛋白是为什么？

detaibio

原核蛋白表达与纯化实验所表达的目的蛋白大多数是以包涵体的形式表现，有些蛋白可以通过降低温度，加快实验速度来改变表达情况，使蛋白表达为可溶性上清蛋白，但是最有效的还是做包涵体复性，这是比较稳妥的，可获得可溶性蛋白的方法，只是活性上会有所降低。

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问病理科的标本（肿瘤）石蜡切片，可以做western blot吗？

zq2008fish

可以的，用过西安晶彩的石蜡组织蛋白提取试剂盒提蛋白，再按常规WB实验操作，做出来效果还不错。

4 回答1659 围观

问Nrf2 这个蛋白怎么做出来？

qinsiman

Nrf2蛋白存在量很少，所以要看你是否用了正确的抗体和跑胶浓度，一般用sant cruz的抗体，且上样量为30-40 ul左右

4 回答5742 围观

问转膜是电流异常升高是为什么？

无情伤流水

一般是配方问题电流过大转膜会出问题

3 回答1696 围观

问为什么曝光出来目的条带总是黑黑的一团，而不是一个小条带？

benjimmy33108

建议上述liona_lin的建议：降低上样量，降低一抗浓度以及调整曝光时间

5 回答3164 围观

问封闭之后需要用 TBST 洗吗？

wd26persist

如果封闭液是5%的牛奶，而一抗稀释液1%de BSA的话，需要用TBST过一下

11 回答11774 围观

问蛋白纯化时为什么检测不到杂蛋白？

kedaxiaoyu

穿透里检测也没有蛋白条带吗？敢问你是用什么洗脱液洗脱的，一般都是用咪唑，0.5M的咪唑柱子上的所有的蛋白基本上都就洗下来了（如果咪唑实在洗不下来的话可以用EDTA洗）……至于你所说的纯化得到目的蛋白，这个咪唑的洗脱浓度还得靠你自己去摸索。你说的是蛋白洗不下来，建议你如果是用低于0.5M的咪唑洗的话，可以考虑0-0.5M的咪唑走个短点的线性梯度，可以大概看下目的蛋白洗脱的大致咪唑浓度。

4 回答2787 围观

问蛋白质免疫印迹一1抗2抗用什么稀释更好？

蜻蜓美女

1，我们实验室是用牛奶加TTBS稀释的，但是磷酸化的抗体一般是BSA加TTBS，效果很好。2，我们实验室是用水。希望对你有帮助

11 回答4941 围观

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