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科研学霸天团,48小时有问必答
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WB组蛋白H3K27
Eason老歌迷
我也遇到过这种情况,一个是你用的maker是不是准确,我有一次用的新maker,它就不准。二是你杂带很多,那就说明可能是你封闭没做好,或者是选的抗体特异性不高。
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35kb的目的蛋白跑成一条线
balalaLy
同一块胶的其它蛋白没问题,说明是这个抗体的问题。抗体失效、降解
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染料法对DNA含量绝对定量
Eason老歌迷
这个A260/280其实就是用来测dna纯度的。用紫外分光光度计测量样品时,不同成分的样品会有不同的吸光度。260纳米(nm)是核酸的最高吸收峰的吸收波长,280nm则是蛋白和酚类的。一般用A260/A280来检验DNA和RNA的纯度,纯DNA的这个比值约为1.8,纯RNA约为2.0.。所以说如果你的dna不纯 你可以先测,然后比对数值,然后纯化。
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问
为什么我跑内参总是出现两个上下相同且平行的条带?
whilt-shirt
这是出现了杂带,有可能是抗体浓度过高,建议增加内参一抗的稀释比例
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问
内参的条带出现深浅不一的话,需要调上样量把他们调的差不多嘛?
whilt-shirt
是的,如果内参不齐审稿人会对你的数据产生质疑
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问
WB显影时内参蛋白有条带,但是目标蛋白没有,显示信号弱出不来条带,有什么解决的办法吗?之前显出来过一次,还是同样的条件就不行了
whilt-shirt
增加目的蛋白一抗浓度或者换用1.5mm的胶增加上样量试试
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超滤后废液有目的蛋白
Eason老歌迷
要是没有特别的破损,你可以试一试清洗下。随着超滤过程的进行,在膜表面逐渐形成凝胶层,使透过通量下降,当通量达到某一最低数值时,就需要进行冲洗,这段时间成为运行周期。运行周期的变化与清洗情况有关。可以使用 0.1-0.5 M NAOH清洗。
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WB煮蛋白的温度和时间
balalaLy
5-10min,95-100度,这个范围内都可以
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问
请教:这种想法是否用蛋白组学测序 即可实现?
Eason老歌迷
思路是没问题的。不过需要注意两点。一个是标本量要多,第二个是要设置重复性实验
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wb背景比较杂
Eason老歌迷
你这背景有点埋汰,脏,有小黑点。可能是封闭液的问题,封闭液是不是有小沉淀。是不是你洗膜没洗干净。
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WB背景有竖纹,该如何解决
Eason老歌迷
想问一下,你是1.0的板还是1.5的板,厚胶容易发生。还有你这是条带笑脸,说明凝胶不均匀冷却,或者是电泳系统温度偏高。
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问
受体和通路的关系
Eason老歌迷
我举个例子吧,同一神经递质,在神经系统的不同部位会表现出不同的兴奋和抑制效应。只要是突触后膜上受体类型不同。受体不同,通路的效应也不同
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诱导过程中,菌体碎屑
Eason老歌迷
你有没有在超净台上操作,是不是有杂菌。然后可能是噬菌体感染。
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问
WB显影
balalaLy
wb是一门玄学,做得越多越能碰上各种奇奇怪怪的情况。有些情况你也解释不清楚,重复做就是了,实在不行换个抗体,还不行,咱换人做。
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求问各位WB大神
balalaLy
转膜转够3小时吧,转膜液中甲醇的浓度可以调低点
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WB条带跑不好
balalaLy
上样体积有点大,loading buffer不能把蛋白压缩,换一种或者往buffer中加一点巯基乙醇。
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LC3B一条带不清晰。
balalaLy
电泳可以再往下跑,差不多把溴芬兰跑出去,转膜时间再延长一下。
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小胶质细胞
天一湖医者
这个目前个人觉得最有效的分离方法,目标:小胶质细胞(microglia)材料:长到已经融合的小鼠脑胶质细胞混和培养(mixed glial culture)Trypsin-EDTA solution (2.5% trypsin, 1 mM EDTA in HBSS; 25200-072)Dulbecco’s modified Eagle medium-F-12 nutrient mixture (
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假如我顺利取下了小鼠脑袋,我要怎么做用于后续的wb、pcr,免疫组化免疫荧光,
balalaLy
脑袋那么大,要取你需要的部位,wb,pcr的组织量只需要米粒大小就够了,分开保存到-80或液氮,组化和荧光的放固定液中
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用Elisa检测细胞上清中的IL-6,请问为什么得到的浓度是负数,就算没有也应该是0啊
balalaLy
蛋白量很低的情况下灵敏度是会降低的。有没有做标准曲线,是不是在可检测范围。
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