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科研学霸天团,48小时有问必答
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qPCR引物二聚体怎么解决?NTC对照扩增出曲线怎么解决?引物冻融多次会影响其特异性吗?为什么我们放-20的引物冻融一次,再做?
毛利小五郎的徒弟
减少引物的使用量,建议把加入引物的量减少一半试试,一般PCR体系里引物是过量的,减少引物的量对PCR反应影响不大,但是能一定程度上降低引物二聚体,毕竟引物少了,两对引物间两两结合的概率也就低了。
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问
SYBR Green 的qPCR产物长度对结果的影响,求助🆘
简简单单的8872
是的,内参600和目的250确实有差异,荧光阈值也会有差异,但是既然有内参,你最后测定的是相对值(目的/内参),应该是同一批实验条件一致即可。另外内参为何不选的小一些,对qPCR来说600有些大了些
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问
重叠延伸pcr连接两段基因的相关问题?
毛利小五郎的徒弟
扩不出来考虑是上样量太小的问题,建议增大上样量。
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问
QPCR扩增曲线不光滑 ,成破浪线是什么原因呀,求大神指点
dxyc42u
很可能是探针的质量不够好,杂质比较多.很可能有部分讲解
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问
qpcr产物条带大小不对
huarenqiang5
可能是做克隆时出问题了,目的片段没有插入到载体上。
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问
同一目的基因跑qpcr和WB时必须选择一样的内参吗?
毛利小五郎的徒弟
不一定非要选择一样的,不一样的也可以。
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问
扩增曲线上升后过了十几个循环开始出现非特异性扩增(排除污染因素),请问为什么出现这种现象以及出现了这种现象应该如何解决?
Dr_劉医生
扩增的温度过大导致循环次数不够,建议控制温度,或者更换引物。
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问
miRNA,cicrRNA的引物设计与编码RNA有什么不同呢?
诸葛靓LR1
1. 研究所用数据库不同这个最easy了。研究什么就得用专门的数据库去搜啊。针对miRNA得用miRbase,针对lncRNA用Noncode,针对circRNA用circBase或者circRNABase。2. 研究时命名规则不同miRNA相对来讲,研究较多,也有一套广为人知的命名体系。一个系统命名包含三部分内容,即物种,microRNA类别,序号。三者间用短线连接。物种一般用三个小写字母表示,
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问
溶解曲线峰值在85-90之间会有什么影响呢?
Dr_劉医生
单看不会有啥影响,溶解曲线光看tm值没有意义,还得看单峰还是双峰,有没有非特异性扩增,而且你tm值也不算下,一般低于70以下考虑有引物二聚体的问题。
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问
我的qpcr扩增曲线有的居然是从零点开始扩增的…请教一下这是咋回事呢
毛利小五郎的徒弟
1. 加样误差导致:定期校准移液器;同时可先配制除模板以外的其他试剂的预混液,然后进行分装再加入模板,其次加大模板上样体积,以上均可降低移液误差的影响。2. 模板浓度越低,重复性越差。建议提高模板量,使Ct值在15-30之间。
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问
荧光定量pcr求助?
蓝莓小布丁
可能是内参基因引物有问题 再试试吧
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问
实验时,pcr条带不在同一条直线上,是模板不纯还是特异性问题?
dxyc42u
可能条件有关,胶是怎么配的,maker是多大,目标片段多大,电泳液浓度,电泳电压和时间,有没有其他异常情况。
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问
PCR荧光定量相关问题?
lanlvmaomao
没有问题,一般是看目的基因和内参基因表达的比值。你也可以调整样品浓度,可以让内参基因ct值降低一些
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问
如果一个基因表达量特别低,用qPCR检测会出现什么情况?另外样品浓度最低多少能够用来当模版?
lanlvmaomao
可能出现ct值很大 然后溶解曲线不特异 这种作为实验结果的话 不可靠。样品浓度需要自己看看,保持目的基因表达ct值在14-20左右 目的基因最好ct值小于30,溶解曲线特异 实验结果才可靠
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问
Taqman探针检测
dxyc42u
ct值不光与灵敏度有关,还与其他因素有关
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问
请问模板的量大概应该控制在多少?
juyue2010
反转录后,取一部分cDNA稀释10倍,加2ul到pcr体系
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问
为什么细胞内DNA复制的引物是RNA?PCR的引物是DNA?
dxyc42u
我认为可能同RNA具有催化、遗传的双重性质有关
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问
PCR技术中加入的“引物”是什么?有什么作用?引物会在PCR仪中复制吗?
dxyc42u
引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补,并能引导模板DNA互补DNA链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体,其3'端必须具有游离的-OH.它按预先设计用化学方法合成,其长短与PCR过程的特异性高低密切相关.一般来说,引物长的,特异性高.
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问
哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR 实验使用?有何需要注意的地方?
dxyc42u
就买专门用来做pcr的管子即可,没啥特别要求,最后盖盖子带上薄膜手套盖
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问
PCR实验室出现污染怎么处理?
juyue2010
全面的紫外照射,过氧化氢消杀,还有核酸消除试剂处理
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