1 ．质粒快速鉴定 试剂： Protoplasting buffer: 30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M 5mM EDTA 0.1ml/0.5M 50mM NaCl 0.1ml/5.0M 20% Sucrose 5ml/40% 50µg/ml RNAseI 50ul/10mg/ml 50µg/ml lysozyme 50ul/10mg/ml 补水至10ml，-20℃分装保存。 Lysis buffer: 89mM Tris-HCl, pH8.0 89mM boric acid 2ml of 5×T

1 ．试剂及配方： 2 x LB （1升）： 20g 氯化钠 20g 蛋白提取物 10g 酵母提取物 加入蒸馏水至1升，用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌 2 x LB－甘油（12.5%）（200ml） 175ml 2 x LB液体 25ml 甘油（100％） 加入蒸馏水至200ml，压灭菌，置于4℃备用 2 ．步骤 1．将cDNA文库转入大肠杆菌，如DH5a(DH10B) 后，取少量菌液涂布氨苄平板，以推算克隆总量。 2．取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体，每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆，可以适当增加2 x LB液体的量，但不能少于此比例 3．按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose 4．70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟. 5．37℃放置1小时 6．加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml 7．加

一、杂交前准备 　　（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。 　　DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2 和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。 　　注意：①DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。 　　（二）载玻片的处理 　　组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下： 　　（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时

一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆 、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技

　　1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10～30μm）最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。 　　在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。 　　下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。 　　（1）PBS洗2×3min。 　　（2）选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。 　　其它切片暂放于PBs 内。 　　RNA酶对照片处理方法：加RNA酶（100μg/ml）在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保

随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。 　　材料： 待标记的DNA片段。 　　设备： 高速台式离心机，恒温水浴锅等。 　　试剂： 　　(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。 　　(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。 　　(3)Klenow片段。 　　(4)20mmol/L DTT。 　　(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。 　　(6)[α-32 P] dATP：比活性&

原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低

（一）、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。 （二）、试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L ris・Cl，0.15mol/L NaCl。BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris・Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L

原位杂交组化（ISHH）与免疫组织化学（IHC）结合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH与IHC结合法可以在相邻切片上分别进行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上进行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色过程中污染有少量RNase的液体所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。 　　一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序 　　（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。 　　（2）0.1 mol/L 甘氨酸PBs 5min。 　　（3）0.4%Triton X-100 PBS

一、DNA探针的应用 　　虽然一般认为DNA探针敏感度不如cRNA探针，但在病毒的检测等领域中DNA探针仍得到广泛的应用。 　　在原位杂交细胞化学的操作步骤方面与cRNA探针基本相同，所不同的是：（1）杂交时需先在高温80～95℃短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅置于冰上冷却。然后置于37℃～42℃杂交过夜。（2）RNA酶的溶液的冲洗不能减低背景，因此，在操作步骤中省略此步。 　　（一）地高辛-碱性磷酸酶（Dig -AKP）标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用 　　1．组织前处理 　　（1）固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更紧贴玻片。 　　（2）脱蜡：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2 ,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以进一步去除蛋白。 　　（3）50℃2×SSC，含5mmol/l

1. 实验目的 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。 2. 实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

一.基本原理 　　核酸分子杂交技术是目前分子生生物学、细胞生物学和生物化学研究中应用最广泛的技术之一，是定性、定量和定位检测两条来源不同的聚核苷酸链上碱基顺序同源性的一种手段。DNA分子是高度有序的双键分子。一条链的碱基与另一条链的碱基以氢键配对相连．形成腺嘌呤与胸腺嘧啶(A．T)，鸟嘌呤与胞嘧啶（G.C）的特定碱基对；在RNA中则为A与U(尿嘧啶)，G与C配对。 　　在碱性环境加热或加入变性剂的条件下，核酸分子双链之间的氢键被破坏，解链成两条单链(称为变性)。此时如果加入已知DNA和RNA片段（称为探针)，在一定的离子强度和温度下，两条具有互补碱基顺序的DNA与相应的cDNA或RNA，RNA与相应的RNA或cDNA均可形成双链分子结构(称为复性)，这种由互补碱基顺序的任何单链核酸分子片段形成双链的过程称为分子杂交(Molecular hybridization)。 　　核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交和原位杂交等三种类型。 　　原位杂交(Hybridization in situ)即原位核酸分子杂交。此法最早(1969)用于细胞内核糖体RNA的

地高辛检测试剂盒 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 货号 : 11745832910 罗氏科学应用部（ Roche Applied Science ）是最早致力于向用户提供非放射标记技术的公司之一，让更多的科研工作者们可以避免使用危险的放射性同位素。自1995 年罗氏专利的地高辛产品上市以来，尽管陆续有许多出色的竞争者涉足这一领域，尽管有定量PCR 技术的应用，DIG 系统仍然是非放射性高效标记―检测技术的首选，被广泛地应用各种膜杂交及原位杂交技术中。 技术原理： 地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid ）物质―― Digoxigenin （DIG ），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片Digoxigenin 在自然界中的唯一来源，因此抗DIG 的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是D

第七章 RFLP和RAPD技术 第一节 概 述 　　DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及

刘光清　刘在新　谢庆阁 (中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州730046) 摘　要: 　反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术, 已广泛应用于生命科学研究的各个领域。综述反向 遗传技术研究进展,并讨论该技术在口蹄疫病毒研究中的应用。 关键词: 　反向遗传学　反向遗传技术　全长cDNA 　口蹄疫病毒 Reverse Genetic Technique and Its Application in FMDV Research Liu Guangqing 　Liu Zaixin 　Xie Qingge ( L anz hou Veteri nary Research Instit ute CAAS , L anz hou 730046) Abstract : 　Reverse genetics is a newly developed technique , and has been applied widely in life science research. The recent development of Reverse

大鼠羟基自由基（HO ・）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆，细胞上清及相关液体样本中羟基自由基（HO ・）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠羟基自由基（ HO ・）水平。用纯化的大鼠羟基自由基（ HO ・）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入羟基自由基（ HO ・），再与 HRP 标记的羟基自由基（ HO ・）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的羟基自由基（ HO ・） 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中大鼠羟基自由基（ HO ・）浓度。 试剂盒组成 ： 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置

大鼠 γ 干扰素 (IFN-γ) 酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆，细胞上清及相关液体样本中 γ干扰素(IFN- γ) 的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中 大鼠 γ 干扰素 (IFN-γ) 水平。用纯化的 大鼠 γ 干扰素 (IFN-γ) 抗体 包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 γ 干扰素 (IFN-γ) ，再与 HRP 标记的 γ 干扰素 (IFN-γ) 受体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 γ 干扰素 (IFN-γ) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中 大鼠 γ 干扰素 (IFN-γ) 含量。 试剂盒组成 ： 试剂盒组成

大鼠 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 酶联免疫分析（ ELISA ） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中 大鼠 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 水平。用纯化的 大鼠 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) ，再与 HRP 标记的 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中 大鼠 葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽 (GIP) 浓度。 试剂盒组

人肾上腺素（EPI ） 酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中 肾上腺素（EPI ） 的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人 肾上腺素（ EPI ） 水平。用纯化的人 肾上腺素（ EPI ） 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 肾上腺素（ EPI ） 再与 HRP 标记的 肾上腺素（ EPI ） 抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 肾上腺素（ EPI ） 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中人 肾上腺素（ EPI ） 浓度。 试剂盒组成 ： , 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置

实验概要 胚胎学实验中需要应用到很多试剂，其中一部分需要实验人员来配制。本 Protocol 的目的是告知胚胎学实验中常规的试剂配制注意事项 实验原理 主要试剂