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人细胞因子引物资料、EMSA等可索取

各位站友:我于2002年开始进行一系列的SNP,人细胞因子RT-PCR检测和核因子-kappa B的EMSA检测,积累了一些资料和引物,目前仍在继续进行该类的研究。如有需要者可与我联系,我将随时赠送给真正需要者,并在赠送前都进行验证以确保引物能P出东东来。我的EMAIL:yubaojun1219@sohu.com以下是我的研究结果和资料。请大家批评指正。基因组DNA的提取:静脉全血2ml加0.5ml ACD(柠檬酸22.8 mM ...

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几个有关primer5.0引物设计的问题,急请各位帮忙!!!

本人刚进实验室,目前在做实验前的准备工作,在引物设计遇到一些困难,希望各位战友能帮帮忙!我的序列如下,为双链RNA病毒,准备做克隆表达。1 gttaaaaatc tatagagatg gacactatcg ccgcaagagc actcactgtg atgcgagcat61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga121 tagctatcaa taggtacaat ggac ...

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【分享】RT-PCR 经验之我谈

看到论坛上有很多朋友询问RT-PCR的重复性问题,说明这里面还是有很多问题的,于是 想跟大家分享一下自己做PCR的经验:1. 总RNA的提取: 材料来源一般为细胞和组织,细胞相对比较单一,蛋白污染较小,TRIZOL法提取结果 A260/A280 结果一般都在1.8-2.1之间;组织的成分较复杂,污染多,提取较纯的RNA有一定难度, 我觉得以下地方需注意:1)最好新鲜取材,不能马上做的标本可以-70度保存,短时间内也不会有什么影响。2)研磨的手法 ...

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自问自答:PCR-SSCP中文步骤讲解(zt)

聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)  聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP)是近年来发展起来的一种基因分析方法。 PCR-SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰 ...

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[分享]从RNA抽提到电泳鉴定(原创)

RNA抽提一,准备工作1,实验器具与材料:(1)移液枪:1ml、200ul、10ul(2)吸头:1ml、200ul、20ul(3)吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个(4)EP管1.5ml、100ul(5)玻璃研磨器(6)容量瓶:1000ml(7)盐水瓶:100ml(8)15ml塑料管一个(配75%乙醇用)2,实验器具的处理与准备(1)塑料制品:(包括吸头、EP管等)将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时 ...

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PCR-聚合酶链反应的进展(转)

PCR-聚合酶链反应的进展北京大学第一医院 朱 平  在聚合酶链反应(PCR)的方法建立以前,面院DNA长链上某种基因的变化有很大难度。1983年由Kry Mullis 等利用当时已经发现的DNA聚合酶,首先建立的体外DNA序列扩增法,基本方法是用寡核苷酸引物扩增位于两个已知序列之间的DNA序片段。反应在DNA聚合酶催化下完成。引物的序列分别与模板基因的序列互补,分别结合在模板DNA对应的两条单链的目的基因的两端随着引物序列从5’ ...

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【资源分享】Neoprimer软件引物设计之我心得

免费引物设计软件Neoprimer引物设计之我心得最近听同学介绍了一款引物设计的软件——Neoprimer软件,融合引物设计的两个基本功能,即引物自动搜索和分析功能,并且使用方便,与Premier Primer相比有过之而无不及。现将我的心得讲述一下:打开序列后就能显示序列和限制性内切酶位点,然后在分析栏可以根据你的需要设计并搜索引物。如果没有特殊要求,建议使用默认设置。可以用于搜索PCR引物,测序引物或杂交探针( ...

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【心得】 我的污染历程

我进实验室后做的以一个实验就是PCR,书上说PCR极易污染,推荐实验过程中要戴口罩帽子手套,要为PCR开辟一个专区等等。受了这样的教诲,我做实验时当然一点都不马虎,每次PCR都做阴性对照和阳性对照,从来都没有污染过,后来渐渐就对书上说的那一套不以为然了,心里说:我在阴性对照里面吐点口水,看你有没有条带出来(不过没有真这么干过呵呵)。后来我做PcR就不再作对照了。在后续的构建重组质粒和测序中也没有出现什么问题。我越 ...

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推荐 PCR 引物设计及软件使用技巧 、实用技巧、问题总结等

PCR技术简介 前言一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。何谓PCR简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In V ...

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【旧贴整理】RACE大全

核酸版race相关问题 请教5race与3race克隆 RACE获得cDNA全长序列,怎么才能知道真的是全长呢? 最近做RACE 遇到一些问题,希望高手指点 请教各位高手:3'RACE的问题 请问做RACE的试剂盒哪个牌子最好? 比较一下5'RACE的这两个Kit 3'race法引物设计 求助克隆新基因-RACE 求助: 有关RACE的问题,谢谢各位高人先 RACE原理 本版race相关问题精华 有没有人用过TAKARA的3‘RACE试剂盒? 5-RACE 问题,急。 RACE PCR ...

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【心得】谈谈PCR引物设计

谈谈PCR引物设计1.简介寡聚核苷酸引物的选择,通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量:若使用设计粗糙的引物,产物将很少甚至没有;而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然 ...

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一篇很好的PCR引物设计文章

PCR 引物设计及软件使用技巧张新宇,朱有康,高燕宁(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所,北京100021)摘要:本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上,详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法,并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件,而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词:PCR;引物设计中图分类号:Q524 文献标识码: 文章编 ...

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pcr-sscp法

PCR-SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其 ...

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来谈谈引物设计软件OLIGO的使用方法及心得吧

对于作PCR的来说,最难的莫过于设计引物了,理论现在已经很多了,但是真正实践起来是要付出一定的心智的,记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物,从没有失手的时候,真是让我佩服得五体投地。最近看了一下OLIGO6.0的使用说明,英文的,感觉有很多地方还是讲得不很明白,比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧:1 从文件菜单打开模 ...

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【原创】RT-PCR实验方法总结大全

RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。要求:1做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。2RT按要求做,一般不会出太大问题。?3PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须在RT时,引物设计有3种方法 ...

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【分享】PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系:       10×扩增缓冲液   10ul       4种dNTP混合物   各200umol/L       引物        各10~100pmol        模板DNA      0.1~2ug        Taq DNA聚合酶   2.5u        Mg2+       1.5mmol/L       加双或三蒸水至  100ul  PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+  引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用 ...

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real-time PCR 常用探针和仪器

1.SYBR Green I:一种DNA结合染料,能非特异性地与双链DNA结合,结合后发出荧光,价格便宜,但因无特异性,易受到非特异性扩增和引物二聚体地的影响,是定量结果不可靠。可用融解曲线分析区分特异性和非特异性扩增,引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光有很大帮助。2.Taqman探针:也称为水解寡核苷酸探针。该探针在5’端标记报告荧光基团,在3’端标记淬灭荧光基团,在探针完整时报告荧光基团发出的荧光被淬灭荧光基 ...

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PCR引物设计及软件使用技巧

在网上找的有关引物设计的材料.虽然自己没有这些软件,也不会用,但想推荐给能用得上的战友.引物设计的原则引物设计有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primer length),产物长度(product length),序列Tm 值(melting temperat ...

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PCR 基因拼接

PCR片段拼接的SOE和SDL方法PCR技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破,它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是,经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接,却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点,这不但操作繁杂,而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法,即SOE和SDL法,就能巧妙地解决这个问题。SOE法1989年,Hor ...

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【分享】定量PCR+Taqman探针设计要领

自90年代Taqman探针诞生以来,虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量PCR技术,Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选,这主要是因为相对于SYBR荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,Taqman探针只要设计一条探针,因此探针设计较便宜方 ...

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