[分享]从RNA抽提到电泳鉴定(原创)
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RNA抽提
一, 准备工作
1, 实验器具与材料:
(1) 移液枪:1ml、200ul、10ul
(2) 吸头:1ml、200ul、20ul
(3) 吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个
(4) EP管1.5ml、100ul
(5) 玻璃研磨器
(6) 容量瓶:1000ml
(7) 盐水瓶:100ml
(8) 15ml塑料管一个(配75%乙醇用)
2, 实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
(2) 玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)
先泡酸过夜,冲洗干净后,在1‰DEPC水中泡8小时左右,37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
(3) 金属制品:(镊子等)
先洗干净,再送干烤3次。(不需要泡DEPC水)
3, 试剂配制和准备:
(1) DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压。
(2) 75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙醇=1:3),然后放于-20℃备用。
(3) 异丙醇:放入棕色瓶
(4) 氯仿:放入棕色瓶
(5) Trizol:100ml/瓶 存放于4℃
二, 抽提时注意事项:
全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三, 抽提步骤
1. 匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下,室温静置5分钟。
2. 分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀,室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。
3. RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul),加入0.5ml异丙醇,混匀后放于-20℃中1小时,后12000rmp离心10分钟。
4. RNA的洗脱
小心倒掉上清,留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次,后7500rmp离心5分钟。
5. RNA的再溶解
小心倒掉上清,取沉淀置超净工作台开风机吹干(约30分钟,此时RNA沉淀变透明)。注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加20ul的DEPC水溶解,在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6,RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录。
TRIzol法抽提总RNA
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
↓
匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)
↓
颠倒混匀10下,室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀15S,室温5分钟
↓
4℃,离心12000rmp,15分钟
↓
转上层水相(约400-500μl)于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400 -500μl),混匀后-20℃中1小时
↓
4℃,离心12000rmp,10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇(用高压后的DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500rmp,5分钟
↓
弃上清,超净工作台开风机干燥约30分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)
(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)
↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录
逆转录(RT)
一, 准备工作
1, 实验器具与材料:
(1)移液枪:200ul、10ul
(2)吸头:200ul、20ul
(3)EP管1.5ml、100ul
(4)水浴箱
2,实验器具的处理与准备
塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)RT中所需要的各种试剂
(3)引物浓度计算方法: (新合成的引物的稀释)
假如终浓度为X uM(pmol/ul)
加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)
二, RT时注意事项:
为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三, RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)
1, 准备0.65ml的EP管
2, 冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。
3, 65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4, 短暂离心后,冰上操作:加入4ul 5×First-Strand Buffer,1ul 0.1MDTT,1ul RNAse Inhibitor,1ul SSⅢ逆转录酶。
5, 短暂离心
6, 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7, 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8, -20℃保存,或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)
1, 准备0.65mlEP管
2, 加入4.5ul DEPC水,1ul引物,1ul模板RNA
3, 稍离心,100℃沸水裕1min
4, 加入0.5uldNTP,2ul 5×Buffer,1ul AMV逆转录酶
5, 稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT
6, 100℃沸水裕3min灭活AMV
7, 立即PCR或-70℃保存。
聚合酶链式反应(PCR)
二, 准备工作
8, 实验器具与材料:
(1)移液枪:200ul、10ul
(2)吸头:200ul、20ul
(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个
(4)EP管1.5ml、100ul
2,实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
3, 试剂配制和准备:
(1) 双蒸水: 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2) PCR中所需要的各种试剂
三, PCR时注意事项:
佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四, PCR步骤
1, 准备100ul EP管
2, 依次在管中加入:(50ul反应体系)
ddH2O 37.5ul ×?
10mM dNTP 1ul ×?
10×PCR buffer 5ul ×?
25mM Mgcl2 (加之前要摇匀) 3ul ×?
上游引物 1ul ×?
下游引物 1ul ×?
模板cDNA 1ul
3, 稍离心
4, 100℃沸水浴1分钟
5, 趁热加入Tag酶0.5ul(冰上操作)
6, 再加入50ul液体石蜡封闭
7, 10000rmp离心1分钟
8, PCR条件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
进行40个循环,然后72℃ 10min 完后4℃保温。
9,10000rmp离心5min
10,将下层水相转入新的0.65mlEP管中,-20℃保存。
电泳鉴定
一,准备工作
1,实验器具与材料:
(1)移液枪:10ul
(2)吸头:20ul
(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个
(4)三角烧瓶:50ml一个
(5)琼脂糖
2,实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
(2)电泳板及电泳槽:
用自来水冲洗干净备用
3, 试剂配制和准备:
(1) 电泳缓冲液(TAE):
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液:将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中,在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0(约需4gNaOH)。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液:在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液,再加蒸馏水定容至500ml,室温保存。
(2)琼脂糖溶液(1.0%):
50×TAE溶液取10ml,稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖,电炉上煮至沸腾,溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中,在室温下放置45min左右后进行电泳。
(3)溴化乙锭(EB)(10mg/ml):
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭,磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中,室温保存。
(4)加样缓冲液(Loading Buffer)一般为6×Loading Buffer
二,电泳鉴定时注意事项:
佩戴一次性手套,避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的,不要超过两周。
五, 电泳步骤
1, 50×TAE取10ml稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。
9, 用透明胶封闭电泳板,琼脂糖溶液冷却至温热时,倒入带梳子的电泳板中,冷却后,拔出梳子,放入电泳槽中。
10, 加样:PCR Marker:1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE混匀于塑料膜上,加入孔中。PCR样品:5ul 样品DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。
11, 接上电源,电压120V,电流50mA进行电泳。
12, 电泳约1小时后,紫外灯检测。
一, 准备工作
1, 实验器具与材料:
(1) 移液枪:1ml、200ul、10ul
(2) 吸头:1ml、200ul、20ul
(3) 吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个
(4) EP管1.5ml、100ul
(5) 玻璃研磨器
(6) 容量瓶:1000ml
(7) 盐水瓶:100ml
(8) 15ml塑料管一个(配75%乙醇用)
2, 实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
(2) 玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)
先泡酸过夜,冲洗干净后,在1‰DEPC水中泡8小时左右,37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
(3) 金属制品:(镊子等)
先洗干净,再送干烤3次。(不需要泡DEPC水)
3, 试剂配制和准备:
(1) DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压。
(2) 75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙醇=1:3),然后放于-20℃备用。
(3) 异丙醇:放入棕色瓶
(4) 氯仿:放入棕色瓶
(5) Trizol:100ml/瓶 存放于4℃
二, 抽提时注意事项:
全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三, 抽提步骤
1. 匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下,室温静置5分钟。
2. 分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀,室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。
3. RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul),加入0.5ml异丙醇,混匀后放于-20℃中1小时,后12000rmp离心10分钟。
4. RNA的洗脱
小心倒掉上清,留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次,后7500rmp离心5分钟。
5. RNA的再溶解
小心倒掉上清,取沉淀置超净工作台开风机吹干(约30分钟,此时RNA沉淀变透明)。注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加20ul的DEPC水溶解,在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6,RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录。
TRIzol法抽提总RNA
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
↓
匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)
↓
颠倒混匀10下,室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀15S,室温5分钟
↓
4℃,离心12000rmp,15分钟
↓
转上层水相(约400-500μl)于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400 -500μl),混匀后-20℃中1小时
↓
4℃,离心12000rmp,10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇(用高压后的DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500rmp,5分钟
↓
弃上清,超净工作台开风机干燥约30分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)
(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)
↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录
逆转录(RT)
一, 准备工作
1, 实验器具与材料:
(1)移液枪:200ul、10ul
(2)吸头:200ul、20ul
(3)EP管1.5ml、100ul
(4)水浴箱
2,实验器具的处理与准备
塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)RT中所需要的各种试剂
(3)引物浓度计算方法: (新合成的引物的稀释)
假如终浓度为X uM(pmol/ul)
加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)
二, RT时注意事项:
为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三, RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)
1, 准备0.65ml的EP管
2, 冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。
3, 65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4, 短暂离心后,冰上操作:加入4ul 5×First-Strand Buffer,1ul 0.1MDTT,1ul RNAse Inhibitor,1ul SSⅢ逆转录酶。
5, 短暂离心
6, 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7, 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8, -20℃保存,或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)
1, 准备0.65mlEP管
2, 加入4.5ul DEPC水,1ul引物,1ul模板RNA
3, 稍离心,100℃沸水裕1min
4, 加入0.5uldNTP,2ul 5×Buffer,1ul AMV逆转录酶
5, 稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT
6, 100℃沸水裕3min灭活AMV
7, 立即PCR或-70℃保存。
聚合酶链式反应(PCR)
二, 准备工作
8, 实验器具与材料:
(1)移液枪:200ul、10ul
(2)吸头:200ul、20ul
(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个
(4)EP管1.5ml、100ul
2,实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
3, 试剂配制和准备:
(1) 双蒸水: 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2) PCR中所需要的各种试剂
三, PCR时注意事项:
佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四, PCR步骤
1, 准备100ul EP管
2, 依次在管中加入:(50ul反应体系)
ddH2O 37.5ul ×?
10mM dNTP 1ul ×?
10×PCR buffer 5ul ×?
25mM Mgcl2 (加之前要摇匀) 3ul ×?
上游引物 1ul ×?
下游引物 1ul ×?
模板cDNA 1ul
3, 稍离心
4, 100℃沸水浴1分钟
5, 趁热加入Tag酶0.5ul(冰上操作)
6, 再加入50ul液体石蜡封闭
7, 10000rmp离心1分钟
8, PCR条件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
进行40个循环,然后72℃ 10min 完后4℃保温。
9,10000rmp离心5min
10,将下层水相转入新的0.65mlEP管中,-20℃保存。
电泳鉴定
一,准备工作
1,实验器具与材料:
(1)移液枪:10ul
(2)吸头:20ul
(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个
(4)三角烧瓶:50ml一个
(5)琼脂糖
2,实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
(2)电泳板及电泳槽:
用自来水冲洗干净备用
3, 试剂配制和准备:
(1) 电泳缓冲液(TAE):
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液:将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中,在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0(约需4gNaOH)。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液:在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液,再加蒸馏水定容至500ml,室温保存。
(2)琼脂糖溶液(1.0%):
50×TAE溶液取10ml,稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖,电炉上煮至沸腾,溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中,在室温下放置45min左右后进行电泳。
(3)溴化乙锭(EB)(10mg/ml):
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭,磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中,室温保存。
(4)加样缓冲液(Loading Buffer)一般为6×Loading Buffer
二,电泳鉴定时注意事项:
佩戴一次性手套,避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的,不要超过两周。
五, 电泳步骤
1, 50×TAE取10ml稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。
9, 用透明胶封闭电泳板,琼脂糖溶液冷却至温热时,倒入带梳子的电泳板中,冷却后,拔出梳子,放入电泳槽中。
10, 加样:PCR Marker:1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE混匀于塑料膜上,加入孔中。PCR样品:5ul 样品DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。
11, 接上电源,电压120V,电流50mA进行电泳。
12, 电泳约1小时后,紫外灯检测。