【心得】 我的污染历程

我进实验室后做的以一个实验就是PCR，书上说PCR极易污染，推荐实验过程中要戴口罩帽子手套，要为PCR开辟一个专区等等。受了这样的教诲，我做实验时当然一点都不马虎，每次PCR都做阴性对照和阳性对照，从来都没有污染过，后来渐渐就对书上说的那一套不以为然了，心里说：我在阴性对照里面吐点口水，看你有没有条带出来（不过没有真这么干过呵呵）。后来我做PcR就不再作对照了。在后续的构建重组质粒和测序中也没有出现什么问题。我越发对污染看的淡了！

最近实验室出了怪现象：一师姐做RT-PCR鉴定细胞系时发现：转染了1，2，3三种质粒的5种细胞都能扩出质粒1来。大惊之下，又作了几次RT-PCR总结实验结果发现：不该出现的条带一时有一时没有！无法确定哪一株细胞受到哪一个质粒的污染！又做，这次加了以水为模版的阴性对照。奇了，阴性对照也有相应条带！把自己用的一套试剂全换了，再做，结果阴性对照时有时无；换另外一个师姐，再换另一套试剂，还是如此！再换我做（我做PCR在实验室是闻名的呵呵），不含糊----我从水里面也给拉出一条500多bp条带！

阴性对照出了阳性结果，无疑是污染！但是问题出在哪里？不可能是试剂污染——全新的三套试剂不可能都污染。我苦苦思索...！！

突然我想起以前一件痛心之事：我同时构建的两个不同的质粒通过测粗验证100%匹配，准备同时大提。就在我大提当天，老板说：最好不要两个一起提，容易污染。可是我已经做上了，而且由于做了那么多PCR都没有污染，心里上并没有足够重视老板的忠告，还是两个一起提的。在提完之后，我i还是做了一下PCR鉴定，结果让我打吃一惊：有交叉污染！再做一次，还是有。问题出在哪里，是大提前做细菌的时候交叉污染还是大提后中污染的呢？我又分别扩增大提前小试管中残留的细菌，小提质粒，PCR鉴定，结果没有问题。再用同样的细菌扩增大提，然后再鉴定，结果没有问题。那么问题就出在大提中。但是，大提是用两个柱子，我每一步都很小心，绝对不会家错东西的，怎么会有交叉污染呢？

当这两件事情交织在一起的时候，我脑海中出现了答案：污染来自我的手！我拿了这个管子，再拿另一个管子的时候出了问题，可能就是几个分子落进EP管中就能导致交叉污染。

后来我又帮师姐重新RT-PCR一次，这次我是在加酶后才加的模版，结果正如我预料的一样，所有阴性对照都只有整齐的二聚体！

为什么以前我怎么做都没有污染呢？因为我以前我只有一个模板，只做一个EP管，加上对照才三个管。又能污染什么呢！

有了这次教训，我再做分子方面的实验就不敢两个东西一起做了！而且再做PCR时最后一个加的不是酶而是模板，这和书上说的不同，但是我想想最后一个加酶的道理无非是怕酶活性减低，但是在做 PCR时酶一直在94-60-72之间循环长达3个小时，那里在乎在常温下多一分钟啊！

我的载体已经构建好了，下一步要做细胞了，书上说细胞之间的交叉污染很常见，我是下了决心要一个一个细胞的做了。

感谢你能看完我这枯燥无味的帖子！