【心得】 我的污染历程
丁香园论坛
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我进实验室后做的以一个实验就是PCR,书上说PCR极易污染,推荐实验过程中要戴口罩帽子手套,要为PCR开辟一个专区等等。受了这样的教诲,我做实验时当然一点都不马虎,每次PCR都做阴性对照和阳性对照,从来都没有污染过,后来渐渐就对书上说的那一套不以为然了,心里说:我在阴性对照里面吐点口水,看你有没有条带出来(不过没有真这么干过呵呵)。后来我做PcR就不再作对照了。在后续的构建重组质粒和测序中也没有出现什么问题。我越发对污染看的淡了!
最近实验室出了怪现象:一师姐做RT-PCR鉴定细胞系时发现:转染了1,2,3三种质粒的5种细胞都能扩出质粒1来。大惊之下,又作了几次RT-PCR总结实验结果发现:不该出现的条带一时有一时没有!无法确定哪一株细胞受到哪一个质粒的污染!又做,这次加了以水为模版的阴性对照。奇了,阴性对照也有相应条带!把自己用的一套试剂全换了,再做,结果阴性对照时有时无;换另外一个师姐,再换另一套试剂,还是如此!再换我做(我做PCR在实验室是闻名的呵呵),不含糊----我从水里面也给拉出一条500多bp条带!
阴性对照出了阳性结果,无疑是污染!但是问题出在哪里?不可能是试剂污染——全新的三套试剂不可能都污染。我苦苦思索...!!
突然我想起以前一件痛心之事:我同时构建的两个不同的质粒通过测粗验证100%匹配,准备同时大提。就在我大提当天,老板说:最好不要两个一起提,容易污染。可是我已经做上了,而且由于做了那么多PCR都没有污染,心里上并没有足够重视老板的忠告,还是两个一起提的。在提完之后,我i还是做了一下PCR鉴定,结果让我打吃一惊:有交叉污染!再做一次,还是有。问题出在哪里,是大提前做细菌的时候交叉污染还是大提后中污染的呢?我又分别扩增大提前小试管中残留的细菌,小提质粒,PCR鉴定,结果没有问题。再用同样的细菌扩增大提,然后再鉴定,结果没有问题。那么问题就出在大提中。但是,大提是用两个柱子,我每一步都很小心,绝对不会家错东西的,怎么会有交叉污染呢?
当这两件事情交织在一起的时候,我脑海中出现了答案:污染来自我的手!我拿了这个管子,再拿另一个管子的时候出了问题,可能就是几个分子落进EP管中就能导致交叉污染。
后来我又帮师姐重新RT-PCR一次,这次我是在加酶后才加的模版,结果正如我预料的一样,所有阴性对照都只有整齐的二聚体!
为什么以前我怎么做都没有污染呢?因为我以前我只有一个模板,只做一个EP管,加上对照才三个管。又能污染什么呢!
有了这次教训,我再做分子方面的实验就不敢两个东西一起做了!而且再做PCR时最后一个加的不是酶而是模板,这和书上说的不同,但是我想想最后一个加酶的道理无非是怕酶活性减低,但是在做 PCR时酶一直在94-60-72之间循环长达3个小时,那里在乎在常温下多一分钟啊!
我的载体已经构建好了,下一步要做细胞了,书上说细胞之间的交叉污染很常见,我是下了决心要一个一个细胞的做了。
感谢你能看完我这枯燥无味的帖子!
最近实验室出了怪现象:一师姐做RT-PCR鉴定细胞系时发现:转染了1,2,3三种质粒的5种细胞都能扩出质粒1来。大惊之下,又作了几次RT-PCR总结实验结果发现:不该出现的条带一时有一时没有!无法确定哪一株细胞受到哪一个质粒的污染!又做,这次加了以水为模版的阴性对照。奇了,阴性对照也有相应条带!把自己用的一套试剂全换了,再做,结果阴性对照时有时无;换另外一个师姐,再换另一套试剂,还是如此!再换我做(我做PCR在实验室是闻名的呵呵),不含糊----我从水里面也给拉出一条500多bp条带!
阴性对照出了阳性结果,无疑是污染!但是问题出在哪里?不可能是试剂污染——全新的三套试剂不可能都污染。我苦苦思索...!!
突然我想起以前一件痛心之事:我同时构建的两个不同的质粒通过测粗验证100%匹配,准备同时大提。就在我大提当天,老板说:最好不要两个一起提,容易污染。可是我已经做上了,而且由于做了那么多PCR都没有污染,心里上并没有足够重视老板的忠告,还是两个一起提的。在提完之后,我i还是做了一下PCR鉴定,结果让我打吃一惊:有交叉污染!再做一次,还是有。问题出在哪里,是大提前做细菌的时候交叉污染还是大提后中污染的呢?我又分别扩增大提前小试管中残留的细菌,小提质粒,PCR鉴定,结果没有问题。再用同样的细菌扩增大提,然后再鉴定,结果没有问题。那么问题就出在大提中。但是,大提是用两个柱子,我每一步都很小心,绝对不会家错东西的,怎么会有交叉污染呢?
当这两件事情交织在一起的时候,我脑海中出现了答案:污染来自我的手!我拿了这个管子,再拿另一个管子的时候出了问题,可能就是几个分子落进EP管中就能导致交叉污染。
后来我又帮师姐重新RT-PCR一次,这次我是在加酶后才加的模版,结果正如我预料的一样,所有阴性对照都只有整齐的二聚体!
为什么以前我怎么做都没有污染呢?因为我以前我只有一个模板,只做一个EP管,加上对照才三个管。又能污染什么呢!
有了这次教训,我再做分子方面的实验就不敢两个东西一起做了!而且再做PCR时最后一个加的不是酶而是模板,这和书上说的不同,但是我想想最后一个加酶的道理无非是怕酶活性减低,但是在做 PCR时酶一直在94-60-72之间循环长达3个小时,那里在乎在常温下多一分钟啊!
我的载体已经构建好了,下一步要做细胞了,书上说细胞之间的交叉污染很常见,我是下了决心要一个一个细胞的做了。
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