师姐 我的细胞又被污染了！

你是不是因为细胞污染影响实验进度而郁闷，还因此被老板批评？可以说，大家都是抗污染过来的，心态要好，不会是第一次，也不会是最后一次，随时做好细胞被污染的准备。

今天我们就来备战：是不是细胞污染？是哪种细胞污染？如何识别？

细菌污染

细胞中如果污染细菌，最常见的有枯草杆菌等革兰阳性菌以及大肠杆菌、假单孢菌等革兰阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会很快出现培养液变混浊，pH 改变。

也有少数培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成实验失败和细胞株 (系) 丢失。

细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

如何预防

● 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够、压力足够。

● 重点检查和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意。

● 下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象，可在培养液中加相应的抗生素处理。

白色念球菌污染

霉菌污染

霉菌污染以后，培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37 度孵箱培养 2-3 天，仍清亮，但出现絮状杂质。镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差。

用硫酸铜溶液擦拭 CO2 孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体, 可以防止霉菌污染。

CO2 孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2 月左右），尤其在多雨的季节。

其它培养箱清洗方法是：用 84 液擦洗－清水擦洗－75% 酒精擦洗－紫外灯照。

如何预防

●可在培养基里加 3u/mL 的两性霉素或制霉菌素或放线菌素 D 或双抗。

●细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素 D 或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。

●将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作。

内皮细胞培养中发现的一个霉菌

霉菌污染

上图是典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。400 倍图片如上。

支原体污染

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。培养液一般会浑浊。

国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。可用泰乐菌素——兽用支原体病的药，无任何不良反应。如果用的是 Sigma 公司的，使用时用 50u g/mL Tylosin 培养液培养 6 天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用 8 ug/mL 的浓度。

支原体污染

支原体污染电镜照片，煎蛋状和其他形状

黑胶虫污染

黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播。低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失。

除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。

黑胶虫污染

真菌污染

一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

真菌污染


高倍镜下的真菌污染

原虫污染

培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

污染的可能原因：配液消毒问题、操作问题、环境问题等等。

关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37 度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。

如何预防

● 孵箱应定期用三氧机消毒或者紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱，同时孵箱内的水应是三蒸水。

● 超净台、取材、器材、培养液、培养瓶、操作等因素

● 超净台的风机不能过大，风机到 6-8 格。否则也可能能致霉菌污染。

● 无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。