细胞被污染了，你发现了么？

用好的血清，细胞一定状态良好？养细胞细心、体贴像照顾小孩纸，细胞一定「平平安安」？但 MTT 等一些细胞实验结果却异常。因为你的细胞已悄悄被支原体污染了。

支原体是一种生命力顽强的细菌，它和其他细菌的区别在于，支原体没有细胞壁，只有柔软的细胞膜。娇小的身材（0.15-0.3μm）让它可以轻松穿过滤器。

由于身形小，培养物不会表现出浑浊或其他明显可见的特征，因此支原体很容易被忽视。但支原体其实已经随着操作者的操作「偷偷地」潜入超净工作台，并附着在血球计数器、移液器、废液缸等物体表面。

常见的支原体污染来源有：

1. 受污染的培养基、血清、或试剂

2. 不彻底的灭菌

3. 培养箱：目前常见的培养箱都带有通气扇和 CO2 瓶，在开、关内门的过程中，被支原体污染的颗粒会被扰动，可能造成细胞污染。其他实验设备的使用也可能造成污染颗粒的扰动，如移液器、离心机等。

4. 液氮

液氮也可以成为传播支原体的媒介。支原体具有顽强的生命力，即使没有经过低温冷藏过程，支原体也可以在液氮里存活。在液氮中，支原体虽然不会增殖，但是仍可以污染保存在其中的细胞，因此建议将冻存管保存在液氮罐的气相层中。

5. 空气悬浮物

在培养过程中产生的悬浮颗粒是微生物污染的最主要来源，一些常见的仪器或普通的实验操作都会产生这些颗粒，例如移液器、真空泵、离心机、冰箱等。携带微生物的颗粒直径多在 4-28μm 之间，在静止空气中，它们以 30 cm/min 的速率移动，因此在密闭、不通风的房间或实验室内，基本不会造成生物污染。

但是，当实验者进入房间时，沉积的颗粒会被扰动，悬浮起来的颗粒则有可能污染细胞。因此严格的无菌操作意识很重要。此外，实验动物也会带来一些被污染的悬浮颗粒。

除上述的情况外，滥用抗生素、密封不严、受污染细胞等也都可能是支原体污染的来源。

支原体污染的危害：

1. 支原体导致细胞密度的减少，并引发细胞不可逆的退化。

2. 支原体吸收、破坏培养基中的精氨酸，抑制细胞生长、引发细胞凋亡，造成细胞活性降低、细胞脱落等现象 。更有甚者，也可能导致染色体畸变，因为精氨酸是细胞核内组蛋白的重要成分。

3. 支原体对 MTT 有还原作用，因此常规的细胞毒性实验 MTT 实验的结果会受到支原体的严重干扰；某些支原体也可以直接诱导树突状细胞的成熟，这对于人体免疫细胞的肿瘤治疗来说，无疑是一个灾难；除此之外，支原体的存在可以显着改变数百个基因的表达水平。

由此可见，支原体不仅影响细胞的健康，也会影响细胞实验的结果。因此，有必要定期检测支原体。

建议在引进新细胞、冻存细胞前或发生细胞房污染等情况时，及时对细胞进行支原体检测，平时对正常培养的细胞也有定期检测的必要，以做到及时发现，及时处理，避免更大的损失。

防止污染的方法

1. 改进无菌技术、严格无菌操作

对新进实验室的人员，要由有经验的人员帮带，严格监督其实验操作；此外建议记录每一次的污染事件，以便分析解决污染问题。

2. 检测外来细胞

因为外来的细胞携带污染很常见，因此，选择可靠的细胞来源非常重要。

在没有独立细胞培养箱的情况下，可疑的细胞培养物应培养在带盖的培养瓶中，不要使用培养板或没有密封的培养皿。此外，处理这类细胞应在一天工作都结束后进行，并且使用独立的培养基和试剂，最后还要对超净工作台进行彻底除菌。

其他方面，如减少悬浮物产生、正确使用抗生素、定期进行支原体检测等，对于防止污染也尤为重要。

支原体检测

ExCell Bio 支原体检测试剂盒针对支原体 DNA 用 PCR 检测可疑样本，其中 PCR 引物通常针对支原体的 16S rRNA 基因。在凝胶电泳过程中，支原体 DNA 会显示为特异性条带，以指示支原体的存在。

支原体检测试剂盒特点：

灵敏度高：能够检测大于 10-20 拷贝的靶 DNA；

检测范围广：涵盖 54 种支原体，彻底排查污染；

普通 PCR 反应即可完成检测，操作不复杂（TAKARA 用巢式 PCR 法、 lonza 用荧光检测和荧光定量 PCR 等方法，操作复杂）；可排除假阴性：宿主阳性对照，结果更准确

1 号样品：细胞裂解液被污染；上清被严重污染

2 号样品：无污染

3 号样品：无污染；-：阴性对照成立；+：阳性对照成立