补体介导细胞毒剔除B细胞及辅佐细胞富集T细胞

T、B淋巴细胞亚群的选择性分离和纯化技术是免疫学研究和应用中最常用的实验之一。这些方法的选择仍要根据所开展的研究，所需要分离的细胞不同做不同的选择。

可以采用细胞毒实验去除淋巴细胞中的B细胞以及单核巨噬细胞等辅佐细胞来获得T淋巴细胞。

补体介导细胞毒剔除B细胞及辅佐细胞富集T细胞的基本原理是应用抗MHCII类分子的抗体与脾脏等来源的小鼠单个核细胞中表达MHCII类分子的细胞结合后形成抗原-抗体复合物，再加入新鲜补体以杀伤这些细胞，就可以获得富集的T淋巴细胞。

试剂：

1.小鼠脾脏来源的单个核细胞

2.已知具有激活补体细胞毒活性的抗-Ia-E单克隆抗体

（或多种抗体的混合物）

3.RPMI 1640，含10％ 胎牛血清的完全培养基

4.兔血清补体（贮存于-70℃ 低温冰箱，需在使用前稀释使用）

仪器：

1.15 ml聚丙烯离心管

2．离心机

补体介导细胞毒剔除B细胞及辅佐细胞富集T细胞的基本过程可分为以下几步：

1．用RPMI 1640完全培养基稀释抗体，此处所用的抗体是无需纯化的抗体，杂交瘤细胞培养上清来源的抗体或腹水来源的抗体均可直接使用。

一般情况下，培养上清进行2倍或4倍稀释，腹水作1500～5000倍稀释，而纯化的单抗使用剂量为1~10 μg/ml。

2．取2支15 ml聚丙烯离心管（分别标记为第一和第二管），将小鼠脾脏来源的单个核细胞悬浮于1 ml稀释抗体中，细胞浓度为1x107／ml，取第三支15 ml离心管（标记为第三管）将细胞悬浮于1 ml培养基中作为补体对照。37 ℃温育30分钟。

3．加入10 ml培养基，混匀后1000 r／min或200 g离心10分钟，弃上清，收集细胞。

4．用不含血清的完全培养基稀释兔血清（1：6～1：12）并过滤消毒。

5．将1 ml补体加入到第一和第三管的细胞中并混匀，第二管仅加入完全培养基作为抗体对照。37 ℃温育30分钟。

（1）每管加入10 ml培养基，混匀后1000 r／min或200 g离心10分钟，弃上清，洗3遍后收集细胞。

建议待分离的细胞用含有10％ 胎牛血清的完全培养基预先清洗，以减少非特异性抗体吸附作用。