尼龙棉柱法富集T淋巴细胞

T、B淋巴细胞亚群的选择性分离和纯化技术是免疫学研究和应用中最常用的实验之一。尼龙棉柱法常用于小鼠T淋巴细胞的收集。

尼龙棉柱法富集T淋巴细胞的基本原理是利用T、B淋巴细胞以及辅佐细胞包括单核巨噬细胞等对尼龙棉不同的黏附特性，将T细胞分离出来（因B细胞和辅佐细胞易于黏附于尼龙棉纤维表面，而T细胞的黏附力较弱）。

试剂：

5.分离获得的人外周血单个核细胞或小鼠脾脏来源的单个核细胞

仪器：

尼龙棉柱法富集T淋巴细胞的基本过程可分为以下几步：

1．尼龙棉柱的准备

（1）将尼龙棉50 g浸泡于装有0.2 mol／L盐酸的烧杯（操作过程中需戴一次性手套），加热至沸腾5～10分钟，用大量蒸馏水漂洗10遍以上（漂洗至第10遍时用pH计测其pH值以判断是否洗干净）。

（2）洗净后将尼龙棉摊在铺有纱布的方盘内，37 ℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内。

（3）将尼龙毛撕匀，取50 ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。用小镊子将其填塞于注射器，约20ml的体积。将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。

2．过柱分离细胞

（1）将20％ 小牛血清的RPMI 1640培养基预热至37 ℃。

（2）将尼龙棉柱固定在支架上，倒入37 ℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，清洗几次尼龙毛，关上阀门。共需用25～50 ml培养液。

（3）将待分离的细胞液用预先加温的培养液配制成5x10／ml的悬液。

（4）将细胞液加入尼龙棉柱，使之刚没过尼龙毛柱。盖上注射器，37 ℃温育45分钟至1小时。

（5）打开下口阀门，缓慢放流（1滴／分钟），可用5～10 ml预热的培养基洗柱。收集流出液至离心管，1000 r／min或200 g离心10分钟，收集T细胞。

（6）通过锥虫蓝染色检查细胞活力，计数细胞，然后根据需要用PBS或合适的培养基将细胞稀释备用。

（7）关闭尼龙棉柱下口，于柱内加入0.85％ 冰生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，快速推出注射器内液体，即获得黏附于尼龙棉上的B淋巴细胞、单核巨噬细胞等。

1．应根据富集的细胞量选择所用的尼龙棉柱，一般情况下，若分离少于1.5x10细胞，需用12 ml尼龙棉柱；1.5x10～3x10细胞，需用20 ml尼龙棉柱。

此法主要用于富集T淋巴细胞，T淋巴细胞的回收率约为20％～30％，纯度约50％～70％。

2．T淋巴细胞也常有一部分被吸附，吸附的多少与尼龙毛的质量和装柱的松紧也有关系。

3．要进一步富集B淋巴细胞，可以利用单核巨噬细胞的易于黏附特性，将单核巨噬细胞和B细胞分开。