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补体介导的细胞毒试验

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【原理】
补体介导的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity test)的原理是特异性抗体与细胞膜上相应抗原 结合后,在补体的参与下,可产生细胞膜损伤,细胞死亡;不带相应抗原的细胞仍然存活。利用染料排斥实验判定淋巴细胞死活状态,活细胞不着色,具有折光性,大小也正常。死细胞着色,体积增大。下面以HLA-A、B、C抗原检测为例。
【材料】
1.Terasaki塑料板(60孔或96孔)、Fisher离心管、Fisher离心机 、水平式离心机、倒置显微镜、血细胞计数板、普通显微镜、毛吸滴管、大试管、中试管、橡皮乳头、温箱、火花真空检测器。
2.肝素抗凝剂(1000U/0.5ml/管)、Hanks液(pH7.2)、McCoy培养基、淋巴细胞分离液(比重1.077)、50 g/L 伊红 Y、34-40%中性甲醛、生理盐水、凝血酶。
3.兔补体 20只以上兔的新鲜血清混合而成,分装于灭菌青霉素小瓶内。在无HLA抗血清时应无淋巴细胞毒性;1;2稀释应仍能使分型血清反应结果记分为8分(见本实验结果判定)。不稀释,-70℃储存备用。用前半小时,取出室温融化,使用后剩余液弃去,不得反复冻融。
4.淋巴细胞悬液
(1)取肝素抗凝外周血10~15ml,1800rpm 离心10~15min。
(2)取白细胞层(1.0~1.5ml)加至含1.5 ml Hanks液的中试管中。
(3)用毛吸滴管混匀,轻轻沿管壁加在盛有1.5 ml淋巴细胞分离液的离心管中,使之重叠于淋巴细胞分离液上,分层良好。
(4)2000 rpm 离心20min。
(5)吸取单个核细胞层细胞,加入Fisher离心管中,用Fisher离心机4000rpm 离心5min。
(6)弃上清,加Hanks液,1500rpm 离心10min,以去除血小板。
(7)弃上清(内有血小板),加Hanks液混匀,加一滴凝血酶。
(8)转动Fisher离心管,促凝,至血小板凝块产生(约2 min左右)。
(9)1500 rpm 离心10min,使血小板凝块沉淀。
(10)取上层悬液转至新Fisher管中,1500 rpm 离心10min。
(11)弃上清(去除凝血酶),加Hanks液重悬细胞,1500 rpm 离心15min,弃上清,重复此步骤1次。
(12)弃上清,用McCoy液悬起细胞,并调整细胞浓度至1.5~2´106/ml。
(13)如细胞悬液中还含有红细胞,可加抗A、抗B、抗H处理,去除。
5.HLA血清板
(1)取干净Terasaki塑料板,各孔中加入一定量石蜡油。
(2)用干净微量注射器加1ml各种已知的对照血清和特异性抗血清于相应各孔中。
(3)置-70℃或-80℃冰箱中保存备用(保存期为6~12个月)。
6.对照血清 阴性对照最好选用健康男性无输血史的AB型血清,56℃30min灭活,或选用56℃30min灭活的健康人混合血清。阳性对照采用马抗人淋巴细胞。
7.特异性抗体 采用经产妇血清、多次受血者的血清、计划免疫 志愿者的血清、肾移植排斥者的血清或单克隆抗体。
【方法】
1.自-80℃冰箱中取出HLA血清板,在室温下融化。
2.标记血清板,标明待检细胞号码。
3.将待检的T淋巴细胞或总的外周淋巴细胞充分混合(1.5´106~2´106/ml)。
4.用软滴法加1ml细胞悬液于各孔中,并使之与血清充分混合(用火花真空检测器混匀),室温(25℃)下30min。
5.每孔加兔补体5ml,室温(25℃)下培养60min。
6.每孔加5ml伊红染液,2 min后,加中性福尔马林5ml于各孔中。
7.将50´75mm2玻片放在血清板上使各孔液滴扁平。置倒置显微镜下检查细胞存活百分率。
【结果】
结果记录以“6”或“8”为确切阳性反应。细胞死亡则被染料着色,细胞呈灰暗色,体积增大,说明细胞表面有与特异的HLA抗体相对应的抗原;如果淋巴细胞表面没有与特异的HLA抗体对应的抗原,则细胞不着色(着色细胞数<10%~19%)。或细胞具有折光性,大小正常。
<10%细胞死亡,记1分,为阴性
11%~19%细胞死亡,记2分,为阴性
20%~29%细胞死亡,记4分,为阳性可疑
30%~80%细胞死亡,记6分,为阳性反应
>80%细胞死亡,记8分,为强阳性反应
在阴性对照和阳性对照结果均正确的情况下,按“多数反应原则”确定受检细胞抗原。若结果异常,须仔细检查每一步操作程序及试剂等是否符合要求,必要时重做。对于初学者,记4分的记录,最好请有经验者复查及判定结果,不要轻易下结论。
【讨论】
1.注意事项
(1)此试验的关键在于获得各种HLA标准抗血清,由于HLA抗体不是天然形成,不需经同种异体抗原刺激产生。目前标准分型血清的主要来源是经产妇和计划免疫者。
(2)要注意淋巴细胞的存度与活性,因为粒细胞和单核细胞能非特异性地吞噬染料而造成细胞损伤的假象;明显的粒细胞和血小板沾染能引起假阴性反应,因为它们与HLA抗体结合,减少结合到淋巴细胞上的抗体;红细胞沾染,在倒置显微镜下很难与小淋巴细胞鉴别。为此本试验用凝血酶等处理,尽量避免其他细胞(红细胞、血小板、粒细胞和单核细胞)沾染。
(3)若测定HLA-DR、DQ抗原时,除淋巴细胞改用B细胞、标准分型血清改用HLA-DR、DQ分型血清及抗B淋巴细胞作阳性对照外,操作步骤(4)、(5)试验条件分别改为37℃培养60min和25℃培养2h,其他与HLA-A、B、C抗原测定相同。
2.方法学评价
该法简单易行,抗血清用量和细胞用量均极少,结果可靠,重复性好,无需特殊仪器设备,故为国际上普遍采用的标准方法。
3.临床意义
HLA分型在免疫遗传学、人类学、器官移植、临床输血、亲子鉴定及疾病相关研究等许多领域都有十分重要的意义和用途。例如在器官移植时,为了提高器官移植的成功率,必须尽量选择比较理想的供者。除ABO血型抗原必须相容外,供者的HLA抗原尽可能与受者接近,尤其是 HLA-D、DR抗原具有更重要意义。
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