补体介导的细胞毒试验方法与步骤

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1、实验原理

带有特异抗原 的靶细胞(如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞)与相应抗体结合后，在补体的参与下，引起靶细胞膜损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料(例如：伊红-Y、台盼蓝)可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验，利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原，亦可鉴定抗体的特异性。

本实验中，Thy-1抗原 是小鼠胸腺T细胞特异的表面抗原，在体外利用抗小鼠Thy-1的单克隆抗体通过补体的协同作用，可杀伤95%以上的胸腺细胞。

2、实验材料

(1)解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80～100目不锈钢网;

(2)试管、lml吸量管、尖吸管;

(3)载玻片、盖玻片;

(4)C57BL/6J小鼠;

(5)含5%NBS 的冷Hank’s液;

(6)抗小鼠Thy-1的单克隆 抗体(最适稀释度，本室制备);

(7)补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收，预先测定效价并稀释为最佳稀释度);

(8)1%伊红-Y染液。

3、实验方法

(1)小鼠胸腺细胞悬液的制备：将4～6周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出胸腺放入已加入约4ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不锈钢网上研磨后，过筛，放入试管，离心1000rpm，5分钟，用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank’s液中，配成1×107/ml细胞悬液。

(2)取试管3支，标明顺序，依据下表依次加入1×107/ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1的单克隆 抗体(最适稀释度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分钟。

实验材料 试验管 补体对照管 细胞对照管 1×107/ml胸腺细胞悬液 0.1ml 0.1ml 0.1ml Thy-1单克隆抗体 0.1ml —— —— Hank’s液 —— 0.1ml 0.2ml 1：3补体 0.1ml 0.1ml ——

(3)取出后每管加入1%伊红-Y染液1滴，混匀，室温放置2分钟。

(4)重新混匀后分别在一张载玻片上滴片，加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察，再用高倍镜观察，比较3管中细胞死活情况。

4、实验结果

死细胞呈红色，无光泽且肿胀变大;活细胞不着色、有光泽且形态正常。

高倍镜下计数200个细胞并计算其中死细胞的百分数。计算公式如下：死细胞百分数= EQ EQ F(实验管死细胞数%-对照管死细胞数%,100%-对照管死细胞数%)

5、注意事项

(1)胸腺细胞制备速度要快，且需在冰浴中进行操作，以保持细胞活力;

(2)抗Thy-1的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定;

(3)细胞对照管死细胞数若超过5%，实验需重新做;

(4)细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。