简介
补体依赖细胞毒实验，是用来判断补体依赖的细胞毒活性。
原理
补体依赖细胞毒实验的基本原理是细胞性抗原与特异性抗体（IgG1,2,3 或 IgM）结合激活补体活化的经典途径，补体活化产生的攻膜复合体可引起细胞膜损伤，损伤细胞膜通透性改变，而使细胞外低渗的液体进入细胞，导致细胞肿胀死亡，可以通过显微镜计数死细胞的多少，来判断补体依赖的细胞毒活性。
用途
补体依赖细胞毒实验可用于该实验可用来检测细胞表面特异性的抗原，也可用于检测制备的抗体是否具有细胞毒性（并非所有抗体与抗原结合后都能激活补体，尤其是单克隆抗体）、淋巴细胞亚群的鉴定、组织相容性抗原的检查与分型、选择性去除某一细胞亚群、单克隆抗体的筛选与鉴定。
材料与仪器
器材：解剖器材、平皿、试管、滴管、载玻片、盖玻片、显微镜、水浴箱。
试剂：
① 补体：新鲜豚鼠混合血清，分装后保存于-20℃，用时以 Hanks 液进行适当稀释；
② 抗 Thy-1 血清、PBS、0.5% 锥虫蓝染液;
步骤
补体依赖细胞毒实验（以抗 Thy-1 血清与小鼠的胸腺或脾 T 淋巴细胞相互作用，通过激活补体对胸腺或脾的 T 细胞进行杀伤为示例）的基本过程可分为如下几步：
（一）靶细胞的制备
A. 小鼠脱臼处死，取出脾脏和胸腺（分别位于左侧腹部和胸骨柄后）分别放到含有 3 ml PBS 平皿中，将 3-4 层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其研磨成单细胞悬液，然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出，调细胞浓度至 5x106/ml。
注意事项：鼠处死要迅速、彻底，防止出血过多，不利于胸腺的分离，亦可事先摘眼球放血。
（二）加样
A. 分别向阳性管中加入 100μl 靶细胞＋100μl 抗 Thy-1 的 McAb，阴性对照管则加入 100μl 靶细胞＋100μl PBS，同时向各管中各加入 100μl 补体。轻轻振荡混匀后，置 37℃ 水浴中孵育 40 分钟。
注意事项：靶细胞需要新鲜分离获得，否则长时间放置可导致细胞自然死亡而影响结果；靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响实验结果。补体要新鲜采集，需三只以上的豚鼠的血清混合。
（三）观察
A. 细胞孵育后，取出试管，于每管中各加入 50μl 锥虫蓝染液，振摇混匀后立即取出染色的细胞悬液滴 1 滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观察。
锥虫蓝拒染法检测细胞活力具体方法：取一定量细胞悬液离心 1000 r/min，5 分钟，弃上清，沉淀细胞用 PBS 或无血清培养基重悬后，与适量 0.5％ 锥虫蓝染色液混合，室温下孵育 3 分钟。于 3～5 分钟内，将混合液滴于计数板上置显微镜下观察计数，分别计数未着色细胞（活细胞）和着色细胞（死细胞）。按照下面公式计算细胞活力：
注意事项：锥虫蓝染色时间及计数时间不要太长，因锥虫蓝本身具有一定的毒性作用，可致细胞死亡。
（四）结果判定
按下式计算细胞毒百分率：
注意事项
1. 小鼠处死要迅速、彻底，防止出血过多，不利于胸腺的分离，亦可事先摘眼球放血。
2. 靶细胞需要新鲜分离获得，否则长时间放置可导致细胞自然死亡而影响结果。
3. 靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响实验结果。
4. 补体要新鲜采集，需三只以上的豚鼠的血清混合。
5. 锥虫蓝染色时间及计数时间不要太长，因锥虫蓝本身具有一定的毒性作用，可致细胞死亡。
来源：丁香实验
