简介
51Cr 释放法检测人抗原特异性细胞毒性 T 细胞功能，是进行 CTL 对靶细胞直接杀伤效应的检测方法。
原理
51Cr 释放法检测人抗原特异性细胞毒性 T 细胞功能的基本原理是标准 51Cr 释放法应用放射性同位素 Na251CrO4 标记靶细胞，若效应细胞能杀伤靶细胞，则 51Cr 从靶细胞内释出。51Cr 辐射 γ 射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中 51Cr 的放射脉冲数（cpm），即可计算出效应细胞的细胞毒活性。
材料与仪器
器材：24 孔圆底培养板、细胞计数板、离心机、水浴锅、震荡仪、γ 计数仪、温箱。
试剂：
① 无血清 RPMI 1640、新生牛血清
② IL-2、丝裂霉素 C ;
步骤
51Cr 释放法检测人抗原特异性细胞毒性 T 细胞功能的基本过程可分为如下几步:
（一）人特异性 CTL 的诱导和制备
A. 效应细胞: 取 HLA-A2 阳性个体外周血 PBL，无血清 RPMI 1640 洗两遍，用含 20％ 的新生牛血清的 RPMI 1640 调成 1.5x106/ml，置于 24 孔板中，于 5％ CO2 培养箱中 4 小时使单核细胞贴壁以去除之，然后收集细胞，计数。
B. 刺激细胞: 取 HLA-A2 限制性的 EB 病毒来源的抗原肽（例如 LMP2A426-434）40 μg/ml 与 T2 细胞 37℃ 孵育 3 小时。无血清 RPMI 1640 液 1000 r/min 离心 6 分钟洗涤后加入丝裂霉素 C，最终浓度为 30 μg/ml，于 37℃ 水浴中作用 30 分钟，1000 r/min 离心 6 分钟，弃上清，沉淀细胞用 RPMI 1640 液洗涤 3 次并计数。
C. 特异性 CTL 的诱导: 取已除去单核细胞的 5x106 PBL 于 24 孔板中，与经上述处理的 T2 细胞 2x105（25:1）作为刺激细胞，混匀，用完全培养基（RPMI 1640）补总体积至 1 ml。静置于培养箱中，4 天后半量换液，继续培养 3 天。第 2 周起，PBL 与 T2 比例为 10:1。每周加刺激细胞一次，共刺激 3 次。其中在第 2 次刺激的第 3 天加入 IL-2（终浓度 20U/ml），并每隔 3-4 天更换一次培养基。在第 3 次刺激结束后，离心收集细胞，即特异性 CTL。
（二）靶细胞的制备 靶细胞为加载相应抗原肽的 T2 细胞。
A. T2 细胞加载抗原肽（LMP2A426-434）: 取 1x106-2x106 T2 细胞与 40 μg/ml 抗原肽 37℃ 共孵育 3 小时。无血清 RPMI 1640 液 1000 r/min 离心 6 分钟洗涤。
B. 丝裂霉素 C 灭活 T2 细胞: 无血清 RPMI 1640 液重悬 T2 细胞，加入丝裂霉素 C，最终浓度为 30 μg/ml，于 37℃ 水浴中作用 30 分钟。1000 r/min 离心 6 分钟，弃上清，沉淀细胞用 RPMI 1640 液洗涤 3 次并计数。
C. 51Cr 标记 T2 细胞: 无血清 RPMI 1640 液重悬 T2 细胞，2x106/0.5 ml，加入 100-200μ Ci51Cr，置 37℃ 水浴 90 分钟，每间隔 15 分钟振摇一次。用含 5％ NCS 的 RPMI 1640 培养液洗涤三次，除去游离的 51Cr。计数活细胞，用完全 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度至 1x105/ml。
（三）效-靶细胞作用
在无菌操作条件下，取效应细胞和靶细胞各 0.1 ml（E/T＝25:1 和 50:1），加入 96 孔培养板内，每份标本做 3 复孔。同时设自然释放对照孔（0.1 ml 靶细胞＋0.1 ml 完全 RPMI1640 培养液）和最大释放孔（0.1 ml 靶细胞＋0.1 ml 2％ SDS），放置 37℃、5％ CO2 温箱内孵育 4 小时，取出后用微量移液器吸出各孔上清 0.1 ml，加于小塑料试管内（勿将细胞吸出），用 γ 计数仪测量 cpm 值。
（四）结果计算
（参考医学免疫学实验第 52 页）
来源：丁香实验
