细胞介导细胞毒作用检测法-4小时51Cr释放法检测CMC活性Cr释放法

4小时51Cr释放法检测CMC活性

1）用51Cr铬酸钠标记靶细胞
短期标记法
1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。
2．如上用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。
3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。

2）4小时51Cr释放实验
1．在96孔圆底 细胞培养 板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E：T）根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100μl完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100μl 1％NP40（或2％ SDS ，1mol/L盐酸）。每个实验置三个复孔。
3．稍稍离心（100×g 3分钟）后，置37℃ 5％ CO2的二氧化碳培养箱中培养4小时。
4．离心培养板200×g 10分钟，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中，在γ－计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（cpm值）。

3）特异性杀伤活性的计算
1．用细胞毒性百分比表示：细胞毒性（％）＝[（实验组cpm－自然释放组cpm）/（最大释放组cpm－自然释放组cpm）]×100％
2．用溶解单位（lytic unit，LU）表示：一个LU是指能溶解一定数量靶细胞的效应细胞数。通常将能溶解30％靶细胞的效应细胞数定位一个LU。结果以106个效应细胞所具有的LU数表示：LU30/106细胞＝106/[（E：T30）×（每孔靶细胞数）] E：T30是该效靶比时效应细胞能杀伤30％靶细胞