细胞介导细胞毒作用检测法1：Cr释放法

4 小时 ⁵¹ Cr 释放法检测 CMC 活性

 

1 ）用 ⁵¹ Cr 铬酸钠标记靶细胞

 

短期标记法

1． 用 RPMI-1640 培养液洗涤 10⁷ 靶细胞，去上清液。用 0.5ml 不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入 100 μ Ci （ 3.7MBq ） ⁵¹ Cr 铬酸钠， 37 ℃水浴中标记 1 小时，每 5 ～ 10 分钟摇晃一次，混匀细胞。

2． 如上用 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 3 次，每次 400 × g 10 分钟。用 50ml RPMI-1640 培养液悬浮细胞，置 37 ℃水浴 30 分钟，以减少非特异的自然释放。

3． 离心 200 × g 10 分钟，去上清液。小心用 RPMI-1640 培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为 0.5 × 10⁵ 或 1 × 10⁵ /ml 备用。

 

 

2 ） 4 小时 ⁵¹ Cr 释放实验

 

1． 在 96 孔圆底细胞培养板中加入 ⁵¹ Cr 标记的靶细胞，每孔加 100 μ l 。

2． 向各孔加 100 μ l 效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比， E ： T ）根据要求而定，通常为 5 ： 1 ～ 20 ： 1 。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加 100 μ l 完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加 100 μ l 1 ％ NP40 （或 2 ％ SDS ， 1mol/L 盐酸）。每个实验置三个复孔。

3． 稍稍离心（ 100 × g 3 分钟）后，置 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的二氧化碳培养箱中培养 4 小时。

4． 离心培养板 200 × g 10 分钟，每孔吸出 100 μ l 上清液置一次性使用的检测管中，在γ－计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每分钟放射性活性（ cpm 值）。

 

 

3 ）特异性杀伤活性的计算

 

1． 用细胞毒性百分比表示：细胞毒性（％）＝ [ （实验组 cpm －自然释放组 cpm ） / （最大释放组 cpm －自然释放组 cpm ） ] × 100 ％

2． 用溶解单位（ lytic unit ， LU ）表示：一个 LU 是指能溶解一定数量靶细胞的效应细胞数。通常将能溶解 30 ％靶细胞的效应细胞数定位一个 LU 。结果以 10⁶ 个效应细胞所具有的 LU 数表示： LU₃₀ /10⁶ 细胞＝ 10⁶ /[ （ E ： T₃₀ ）×（每孔靶细胞数） ] E ： T₃₀ 是该效靶比时效应细胞能杀伤 30 ％靶细胞