细胞介导细胞毒作用检测法3：LDH释放法

LDH 释放法

 

1 ）测定方法

 

1． 用含 5 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将靶细胞调整到 5 × 10⁴ ～ 2 × 10⁵ /ml ，此浓度需根据情况预先标定。

2． 在 96 孔圆底细胞培养板中加入靶细胞，每孔加 100 μ l 。 3 个效应细胞自然释放对照孔不加靶细胞，只加 100 μ l 培养液。

3． 向各孔加 100 μ l 效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为 5 ： 1 ～ 20 ： 1 。自然释放孔不加效应细胞只加 100 μ l 培养液，最大释放孔中加 100 μ l 1 ％ NP₄₀ 。每个实验置三个复孔。

4． 置 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的二氧化碳培养箱中培养 4 ～ 6 小时。

5． 离心培养板 200 × g 10 分钟。每孔吸出 150 μ l 上清液，对应加入另一块 96 孔酶联检测板中。向第二块板每孔依次加 20 μ l 0.4mol/L 乳酸溶液、 20 μ l 4mmol/L 2-p- 碘苯酯 -3-p- 氯化硝基苯四唑， 20 μ l 反应液（含 0.03 ％ BSA ， 2.7U/ml 硫辛酰胺脱氢酶， 4.5mmol/L 氢化型辅酶 I （ NAD ^＋ ）， 1.2 ％蔗糖的 PBS ），室温中放置 20 分钟。

6． 在酶联检测仪上测定各孔的光密度（ OD 值），检测波长 492nm ，参考波长 650nm 。

 

 

2 ）特异性杀伤活性的计算

 

杀伤活性（％）＝ [ （ OD 实验组－ OD 总自然释放） / （ OD 最大释放组－ OD 总自然释放） ] × 100 ％