细胞介导细胞毒作用检测法2：[3H]脱氧胸苷释放法

[³ H] 脱氧胸苷释放法

 

1 ）标记靶细胞

 

1． 用含 5 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将靶细胞配成 2 × 10⁶ /ml ，取 10 μ Ci （ 370kBq ） [³ H]TdR 加到 1ml 靶细胞中， 37 ℃水浴标记 4 ～ 6 小时，每 30 分钟摇晃一次。

2． 用 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 3 次，每次 400 × g 10 分钟。用含 5 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞浓度调整为 1 × 10⁵ /ml 备用。

 

 

2 ） [³ H]TdR 释放实验

 

1． 在 96 孔圆底细胞培养板中加入标记的靶细胞，每孔加 100 μ l （含 1 × 10⁴ 细胞）。

2． 向各孔加 100 μ l 效应细胞，效应细胞与靶细胞比例根据要求而定，通常为 5 ： 1 ～ 20 ： 1 。阴性对照孔不加效应细胞只加 100 μ l RPMI-1640 培养液。阳性对照孔中加 100 μ l 1 ％ NP₄₀ 。每个实验置三个复孔。

3． 置 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的二氧化碳培养箱培养 18 小时。

4． 离心培养板 200 × g 10 分钟，从每孔中吸出 150 μ l 上清液。每孔加 150 μ l 含 1mg/ml 胰蛋白酶和 10 μ g/ml DNA 酶的 Hanks 液，在 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的二氧化碳培养箱中继续培养 30 分钟。

5． 稍振荡后离心沉淀细胞。每孔吸出 100 μ l 上清液置液闪瓶中。

6． 每孔加 100 μ l 5 ％三氯醋酸，用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用 5 ％三氯醋酸洗滤纸 3 次，将滤纸置液闪瓶中。

7． 在液闪计数仪上分别测定上清液中细胞中的每分钟放射性活性（ cpm 值）。上清液 cpm × 2 是死细胞释放的 cpm ；细胞 cpm ＋上清液 cpm × 2 代表总 cpm 。

杀伤活性（％）＝ [ （上清液 cpm × 2 ） / （细胞 cpm ＋上清液 cpm × 2 ） ] × 100 ％