原理
乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，由于细胞膜通透性改变，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH再催化乳酸的过程中，使氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）变成还原型辅酶（NADH2），后者再通过递氢体－吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑蓝（NBT）形成有色的甲基化合物，再490 nm 或570
nm波长处有一吸收峰，利用读取的A值，即可测得杀伤细胞毒活性。
材料与仪器
靶细胞
PBS NaCl KH2PO4 NaHPO4•12H2O 乳酸钠 LDH底物溶液 硝基蓝四氮唑 PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 枸橼酸
离心机 分光光度计 摇床
PBS NaCl KH2PO4 NaHPO4•12H2O 乳酸钠 LDH底物溶液 硝基蓝四氮唑 PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 枸橼酸
离心机 分光光度计 摇床
步骤
一、材料准备
2. 效应细胞制备
（1）将小鼠颈椎脱位处死，用酒精棉球消毒腹部，剪开腹部皮肤和腹膜，无菌取脾脏，出去脂肪膜等，放入加有约5 ml PBS液的平皿中，用5 ml 注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。
（2）如此反复冲洗，直到脾脏变白为止（约冲洗5~6次），将细胞移入离心管内，离心洗1次，1000 r/min 离心5~10分钟，重复洗1次，用10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，计数细胞，并调细胞浓度至1×107 /ml。
二、操作步骤
1. 孵育：取效应细胞和靶细胞各0.1 ml（E：T＝100：1）加入细胞培养板中，设3复孔，同时设靶细胞自然释放孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml1%NP40液），1000 r/min，低速离心2分钟。置37℃，5%CO2孵育2小时。1000 r/min，离心5分钟。
2. 测定：吸取各孔上清0.1 ml 加至新96孔板中，37℃，10分钟。每孔再加入0.1 ml 新配制的LDH底物溶液，室温避光反应10~15分钟。加入30 µl 1 mol/L 枸橼酸终止液终止酶促反映。酶联监测仪在570 nm波长下读各孔A值。
3. 计算：根据下列公式计算NK细胞活性
1. 靶细胞制备
（1）取传代培养24~28小时对数生长期的YAC-1细胞，用RPMI-1640培养液洗涤2次1000 r/min 离心5分钟。
（2）10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，并用0.5%台盼蓝染色检测细胞存活大于95%，调整细胞浓度至1×105/ ml。
（1）取传代培养24~28小时对数生长期的YAC-1细胞，用RPMI-1640培养液洗涤2次1000 r/min 离心5分钟。
（2）10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，并用0.5%台盼蓝染色检测细胞存活大于95%，调整细胞浓度至1×105/ ml。
2. 效应细胞制备
（1）将小鼠颈椎脱位处死，用酒精棉球消毒腹部，剪开腹部皮肤和腹膜，无菌取脾脏，出去脂肪膜等，放入加有约5 ml PBS液的平皿中，用5 ml 注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。
（2）如此反复冲洗，直到脾脏变白为止（约冲洗5~6次），将细胞移入离心管内，离心洗1次，1000 r/min 离心5~10分钟，重复洗1次，用10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，计数细胞，并调细胞浓度至1×107 /ml。
二、操作步骤
1. 孵育：取效应细胞和靶细胞各0.1 ml（E：T＝100：1）加入细胞培养板中，设3复孔，同时设靶细胞自然释放孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml1%NP40液），1000 r/min，低速离心2分钟。置37℃，5%CO2孵育2小时。1000 r/min，离心5分钟。
2. 测定：吸取各孔上清0.1 ml 加至新96孔板中，37℃，10分钟。每孔再加入0.1 ml 新配制的LDH底物溶液，室温避光反应10~15分钟。加入30 µl 1 mol/L 枸橼酸终止液终止酶促反映。酶联监测仪在570 nm波长下读各孔A值。
3. 计算：根据下列公式计算NK细胞活性
来源：丁香实验
![2,4,8,10-四叔丁基-12H-二苯并[d,g][1,3,2]二氧磷杂环辛磷酸钠-6-酸钠6-氧化物，85209-91-2，阿拉丁](https://img1.dxycdn.com/p/s14/2024/0619/895/6509476563029633081.jpg!wh200)
