乳酸脱氢酶释放法

最新修订时间：2022-02-10

原理

乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，由于细胞膜通透性改变，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH再催化乳酸的过程中，使氧化型辅酶Ⅰ（NAD⁺）变成还原型辅酶（NADH₂），后者再通过递氢体－吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑蓝（NBT）形成有色的甲基化合物，再490 nm 或570 nm波长处有一吸收峰，利用读取的A值，即可测得杀伤细胞毒活性。

材料与仪器

靶细胞
PBS NaCl KH2PO4 NaHPO4•12H2O 乳酸钠 LDH底物溶液硝基蓝四氮唑 PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）枸橼酸
离心机分光光度计摇床

步骤

一、材料准备

1. 靶细胞制备

（1）取传代培养24~28小时对数生长期的YAC-1细胞，用RPMI-1640培养液洗涤2次1000 r/min 离心5分钟。

（2）10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，并用0.5%台盼蓝染色检测细胞存活大于95%，调整细胞浓度至1×10⁵/ ml。

2. 效应细胞制备

（1）将小鼠颈椎脱位处死，用酒精棉球消毒腹部，剪开腹部皮肤和腹膜，无菌取脾脏，出去脂肪膜等，放入加有约5 ml PBS液的平皿中，用5 ml 注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。

（2）如此反复冲洗，直到脾脏变白为止（约冲洗5~6次），将细胞移入离心管内，离心洗1次，1000 r/min 离心5~10分钟，重复洗1次，用10%FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，计数细胞，并调细胞浓度至1×10⁷ /ml。

二、操作步骤

1. 孵育：取效应细胞和靶细胞各0.1 ml（E：T＝100：1）加入细胞培养板中，设3复孔，同时设靶细胞自然释放孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml1%NP40液），1000 r/min，低速离心2分钟。置37℃，5%CO₂孵育2小时。1000 r/min，离心5分钟。

2. 测定：吸取各孔上清0.1 ml 加至新96孔板中，37℃，10分钟。每孔再加入0.1 ml 新配制的LDH底物溶液，室温避光反应10~15分钟。加入30 µl 1 mol/L 枸橼酸终止液终止酶促反映。酶联监测仪在570 nm波长下读各孔A值。

3. 计算：根据下列公式计算NK细胞活性

来源：丁香实验