放射性核素释放

一、材料准备

1.  靶细胞制备

（1）取传代培养24~48小时对数生长期的K562，用RPMI-1640培养液洗涤2次，用10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度4×10⁶/ml。

（2）0.5 ml K562细胞悬液加3.7~7.4MBq（100~200uCi）⁵¹Cr，5%CO₂，37度孵育90分钟，每个15分钟振摇一次。

（3）RPMI-1640培养液洗涤3次，洗去未标记的游离⁵¹Cr。

（4）10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10⁵/ml，同时检测细胞的⁵¹Cr标记率，一般要求标记率＞0.1 cpm/cell。

（5）如暂时不用，可放置4度保存12小时。

 

2.  效应细胞制备：淋巴细胞分层液分离人PBMC，10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10⁷/ml

二、操作步骤
 

1.  加样：取上述效应细胞和靶细胞各0.1 ml（E：T=100：1）加入96孔培养板内，3复孔。同时设自然释放对照孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1ml靶细胞+0.1 ml 2%SDS）。37度，5%CO₂孵育4小时。

 

2.  测定：1000 r/min 离心培养板5分钟，用微量移液器吸出各孔上清0.1 ml，加于计数管内，用γ计数仪测定放射活性cpm值。

 

3.  计算：根据下式计算51Cr自然释放率和NK细胞毒活性

^（1）51Cr自然释放率（%）=（自然释放孔cpm值）/（最大释放孔cpm值）×100%

（2）NK细胞毒活性（%）=（试验孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）/（最大释放对照孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）×100%

1.  靶细胞的质量非常重要，用台盼蓝拒染色法检测K562靶细胞的存活率应＞95%。标记后的自然释放率应＜15%。

2.  效靶细胞比率一般选择50~100：1，其自然杀伤率不再呈对数增加，标本用量过大。

3.  由于放射性核素具有毒性，标记的靶细胞不宜放置过久，与效应细胞作用时间也不宜过长，因随时间的延长死细胞增多，自然释放率也随之增高。