细胞介导细胞毒作用检测法-[3H]脱氧胸苷释放法

 

[ ³ H] 脱氧胸苷释放法

1 ）标记靶细胞

1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成2×10 ⁶ /ml，取10μCi（370kBq）[ ³ H]TdR加到1ml靶细胞中，37℃水浴标记4～6小时，每30分钟摇晃一次。

2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调整为1×10 ⁵ /ml备用。

 

2 ）[ ³ H]TdR 释放实验

1．在96孔圆底 细胞培养 板中加入标记的靶细胞，每孔加100μl（含1×10 ⁴ 细胞）。

2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔不加效应细胞只加100μl RPMI-1640培养液。阳性对照孔中加100μl 1％NP ₄₀ 。每个实验置三个复孔。

3．置37℃ 5％ CO ₂ 的二氧化碳培养箱培养18小时。

4．离心培养板200×g 10分钟，从每孔中吸出150μl上清液。每孔加150μl含1mg/ml胰 蛋白酶 和10μg/ml DNA酶的Hanks液，在37℃ 5％ CO ₂ 的二氧化碳培养箱中继续培养30分钟。