简介
目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。51Cr 释放实验测定自然杀伤细胞活性依据 51Cr 的物理半衰期计算 NK 细胞活性。
原理
51Cr 释放实验测定自然杀伤细胞活性的基本原理是 Na251CrO4 能进入到细胞内，与细胞质蛋白质牢固地结合，51Cr 的物理半寿期为 27.72 天。当标记 51Cr 的细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出 51Cr。51Cr 辐射 γ 射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的 51Cr，即可计算出 NK 细胞活性。
材料与仪器
试剂：
1. 含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液
2. 0.5％ 锥虫蓝染色液
仪器：
1. 离心机
2. 显微镜
3. 细胞计数板
4. 96 孔细胞培养板
5. CO2 培养箱
步骤
51Cr 释放实验测定自然杀伤细胞活性的基本过程可分为以下几步：
1、效应细胞的制备
常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞，洗涤并用含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮，计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。
2、靶细胞的制备
取培养 24～48 小时的靶细胞 2x106/0.5 ml，加入 100～200 μ Ci51Cr，置 37 ℃ 水浴 90 分钟，每间隔 15 分钟振摇一次。然后用含 5％ NCS 的 RPMI 1640 培养液洗涤三次，除去游离的 51Cr。计数活细胞，用完全 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度至 1x10/ml，如暂时不用，可放置 4 ℃ 冰箱内保存。同时应检测细胞的 51Cr 标记率，一般要求标记率 ＞ 0.1 cpm/细胞。
3、效-靶细胞作用
（1）在无菌操作条件下，取效应细胞和靶细胞各 0.1 ml（E/T = 12.5:1～100:1），加入 96 孔培养板内，每份标本做 3 复孔。同时设自然释放对照孔（0.1 ml 靶细胞＋0.1 ml 完全 RPMI 1640 培养液）和最大释放孔（0.1 ml 靶细胞＋0.1 ml 10％ Triton-X100 液）。
（2）96 孔培养板 200 g 离心 3 分钟，放置 37 ℃、5％ CO2 温箱内孵育 4 小时。
（3）400 g 离心 5 分钟，取出后用微量移液器吸出各孔上清 0.15 ml（勿将细胞吸出），加于小塑料试管内；
（4）用 γ 计数仪测量 cpm 值（受损伤或死亡靶细胞释放到上清中 51Cr 的放射脉冲数）。
4、结果计算
根据下式计算 51Cr 自然释放率和 NK 细胞活性：
注意事项
（1）在一定范围内，NK 细胞活性与效靶比值成正比，一般效靶比值应小于 100。
（2）靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率 ＜ 10％。
（3）吸取细胞培养上清时，应尽可能不吸动沉淀的细胞。
（4）进行同位素释放实验时，各管（孔）加入的靶细胞不能太少，且靶细胞的同位素标记率也不能太低，否则会增加实验误差。
（5）用同位素标记靶细胞时，每次实验应根据 51Cr 或 125I-UdR 的半寿期适当调整需要的同位素用量。
（6）应用同位素释放法时，应注意实验防护和环境污染等问题。
（7）在测量吸收值时测量孔中不应有气泡，如果有可用针头刺破之。
来源：丁香实验
