简介
目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。形态学方法测定自然杀伤细胞活性是依据细胞膜通透性区别死细胞和活细胞
原理
形态学方法测定自然杀伤细胞活性的基本原理是当 NK 细胞与靶细胞结合、杀伤并使之死亡后，靶细胞的细胞膜通透性改变而使锥虫蓝染料透入细胞内，细胞着色呈蓝色，折光性强，体积大小正常；借此可区别死细胞和活细胞，计算出靶细胞的死亡率即为 NK 细胞活性。
材料与仪器
试剂：
1. 含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液
2. 0.5％ 锥虫蓝染色液
仪器：
1. 离心机
2. 显微镜
3. 细胞计数板
4. 96 孔细胞培养板
5. CO2 培养箱
步骤
形态学方法测定自然杀伤细胞活性的基本过程可分为以下几步：
1、效应细胞的制备
常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞，洗涤并用含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮，计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。
2、靶细胞的制备
取经 24 小时培养的靶细胞，用完全 RPMI 1640 培养液洗涤 1 次，1000 r/min 离心 5～10 分钟。去上清，用完全 RPMI 1640 培养液重悬后计数，并用 0.5％ 锥虫蓝染色检测活性，活细胞应大于 95％，调整细胞浓度至 2x10/ml 备用。
3、效-靶细胞作用
（1）用 96 孔细胞培养板，对照组 3 孔，每孔加 100 μl 靶细胞，再加入完全 RPMI 1640 营养液 100 μl；
（2）实验组 3 孔，每孔加 100 μl 靶细胞，再加入效应细胞 100 μl，效/靶细胞（E/T）比例为 12.5:1～100:1；
（3）混匀，置 37 ℃、5％ CO2 温箱中培养过夜。
4、结果观察
取出培养板，将细胞轻轻混匀成悬液，从每孔中取出 30 μl 细胞悬液，加入等量的 0.5％ 锥虫蓝染液混合，室温下染色 5 分钟，于白细胞计数池中计数。对照组和实验组每孔各计数 200 个细胞，分别记录死亡细胞和活细胞数，按下述公式求出各组 NK 细胞活性均值。计算公式如下：
注意事项
（1）在一定范围内，NK 细胞活性与效靶比值成正比，一般效靶比值应小于 100。
（2）靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率 < 10％。
（3）吸取细胞培养上清时，应尽可能不吸动沉淀的细胞。
来源：丁香实验
