🔥 靶细胞 CSFE 标记的流式细胞术检测法测定自然杀伤细胞活性

目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。CFSE 是一种可对活细胞进行标记的荧光染料，可自由穿透细胞膜，进入细胞内被酯酶转化成带负电荷的 CFSE，并释放荧光。

靶细胞 CSFE 标记的流式细胞术检测法测定自然杀伤细胞活性的基本原理是羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE），是一种可对活细胞进行标记的荧光染料，可自由穿透细胞膜，进入细胞内被酯酶转化成带负电荷的 CFSE，并释放荧光。碘化丙啶（PI）可与凋亡细胞质内的 DNA 结合。

如效应细胞与靶细胞混合前将靶细胞先用 CFSE 染色，与效靶细胞作用后再用 PI 染色，即可严格区分靶细胞的凋亡和效应细胞的死亡情况，即 CFSE^＋ PI⁺ 双阳性细胞为特异性死亡的靶细胞，通过流式细胞术即可准确测定靶细胞的死亡情况，从而测定效应细胞的杀伤活性。

试剂：

含 15% FCS 的 RPMI 1640 营养液

仪器：

1. 离心机

2. 显微镜

3. 细胞计数板

4. 96 孔细胞培养板

5. CO₂ 培养箱

靶细胞 CSFE 标记的流式细胞术检测法测定自然杀伤细胞活性的基本过程可分为以下几步：

1、效应细胞的制备常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞，洗涤并用含 15% FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮，计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。

2、靶细胞的制备细胞用量根据实验设计而定，每个实验孔至少需要 10 个细胞。取培养 24～48 小时的靶细胞，室温 400 g 离心 10 分钟，PBS 洗涤 2 次。PBS 重悬细胞，调整细胞浓度为 1x10⁷/ml，每毫升体积加入 2 μl CFSE（0.5 mmol/L），37 ℃ 孵育 10 分钟，期间轻轻颠倒混匀 2 次。孵育后，室温 400 g 离心 10 分钟，PBS 洗涤 2 次。

3、效-靶细胞作用分别计数及收集 NK 细胞，CSFE 标记的 K562 细胞，用 NK 细胞培养基重悬至 1x10/ml。

设立空白对照（仅加未标记的 K562 细胞）、阴性对照（仅加 CSFE 标记的 K562 细胞，用于检测靶细胞自发裂解）、阳性对照（仅加 CSFE 标记的 K562 细胞，用于检测靶细胞自发裂解 CSFE 荧光检测）及实验组（NK 细胞及 CSFE 标记的 K562 细胞），各 3 孔。

用 96 孔 U 型细胞培养板，在空白对照、阴性及阳性对照孔中分别加入 50 μl 上述细胞（0.5 x 10⁶）。设效靶比为 10:1，实验组加入 100 μl NK 细胞（1 x 10⁶）和 10 μl CSFE 标记的 K562 细胞（1 x 10⁵）。

所有各孔用 NK 细胞培养基加至每孔 200 μl。置 37 ℃、5% CO₂ 温箱中培养 6 小时。收集细胞至流式检测管，离心，去上清，用 1xPBS 清洗 3 遍，加入 1xPBS 300 μl 重悬细胞。在实验孔中加入 5 μl PI 染料，暗室孵育 30 分钟，离心，去上清，用 1xPBS 清洗 3 遍，1% 多聚甲醛固定，FACS 测定。

4、结果测定和分析 CFSE/PI 可有效标记各细胞群为 CFSE⁺ PI^-、CFSE⁺ PI⁺、CFSE^- PI⁺、CFSE^- PI^- 4 个 组群，其中 CFSE⁺ PI^- 为未被杀伤的靶细胞，CFSE^＋ PI⁺ 为杀伤的靶细胞，CFSE^- PI⁺ 为培养过程中死亡的效应细胞，CFSE^- PI^- 为存活的效应细胞，通过流式分析软件计算 CFSE⁺ PI⁺ 杀伤靶细胞的百分率。

（1）在一定范围内，NK 细胞活性与效靶比值成正比，一般效靶比值应小于 100。

（2）需要加入 CSFE 标记的 K562 细胞组，用于检测靶细胞自发裂解。

（3）最佳 CSFE 使用浓度，需要预实验确定。