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125I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性

相关实验:自然杀伤细胞活性测定

最新修订时间:

简介

目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。125I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性是依据 125I 的物理半衰期来检测细胞活性。

原理

125I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性的基本原理是 125I-2'脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)是胸腺嘧啶核苷的类似物,作为 DNA 合成的前体物,它能相当特异地取代胸腺嘧啶核苷掺入到细胞核 DNA 链上,125I 的物理半寿期为 59.7 天。因此,可用 125I-UdR 标记体外传代培养的靶细胞,以外周血分离的单个核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞,进行体外 NK 细胞活性检测。被效应细胞杀伤的靶细胞可释放 125I-UdR,用 γ- 计数仪测定其放射性强度,以 125I-UdR 释放百分率表示 NK 细胞的活性。

材料与仪器

试剂:

1. 含 15% FCS 的 RPMI 1640 营养液

仪器:

1. 离心机

2. 显微镜

3. 细胞计数板

4. 96 孔细胞培养板

5. CO2 培养箱

步骤

125I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性的基本过程可分为以下几步:

1、效应细胞的制备


常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞,洗涤并用含 15% FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮,计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。


2、靶细胞的制备


取培养 24~48 小时的靶细胞 1 ml(5x105/ml),分别加入 5-FudR 4~6 μl 和 125I-UdR 6 μCi,混匀,置 37 ℃ 培养 2 小时,取出后用含 5% NCS 的 RPMI 1640 培养液洗涤 3 次,每次离心 1500 r/min,2 分钟,最后用完全 RPMI 1640 培养液悬浮,计数活细胞。用 γ- 计数仪检测标记率,一般可达 1~2 cpm/细胞。


3、效-靶细胞作用


调整效应细胞和标记的靶细胞浓度,分别加入塑料试管中,效/靶细胞比例为 12.5:1~100:1。同时设只加标记靶细胞的自然释放对照管(同5Cr法),每份标本和对照管均设 3 个复管,每管均用完全 RPMI 1640 培养液补足体积至 1 ml,混匀,离心 1500 r/min,2 分钟,以促进效-靶细胞作用,置 37 ℃、5% CO2 温箱中培养 18 小时。


4、酶处理


取出效/靶细胞培养物,1500 r/min,离心 2 分钟,弃上清,于每管中加入胰蛋白酶(用无 Ca2+、Mg2+的 Hanks 液配制成 3 mg/ml,小量分装,-20 ℃ 冻存)和 DNA 酶(用 Hanks 液配成 50 μg/ml,小量分装,-20 ℃ 冻存。)各 0.1 ml,混匀后置 37 ℃ 水浴 30 分钟,促使已受损伤的靶细胞释放 125I-UdR,然后于各管中加入 0.8 ml 冷 Hanks 液,以终止酶反应。1500 r/min 离心 2 分钟,分别吸出各管上清 0.5 ml 置于另一个塑料试管中。


5、放射性测量和结果计算


用 γ- 计数仪分别测量每管上清和细胞部分的 cpm 值,并按下式计算 125I-UdR 释放率和 NK 细胞活性,取三管均值作为 NK 细胞活性。


注意事项

(1)在一定范围内,NK 细胞活性与效靶比值成正比,一般效靶比值应小于 100。

(2)靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率 < 10%。

(3)吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细胞。

(4)进行同位素释放实验时,各管(孔)加入的靶细胞不能太少,且靶细胞的同位素标记率也不能太低,否则会增加实验误差。

(5)用同位素标记靶细胞时,每次实验应根据 51Cr 或 125I-UdR 的半寿期适当调整需要的同位素用量。

(6)应用同位素释放法时,应注意实验防护和环境污染等问题。

(7)在测量吸收值时测量孔中不应有气泡,如果有可用针头刺破之。

来源:丁香实验

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