125I-UdR释放试验测定NK细胞活性

基本原理

125I-UdR（125I-2′脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷的类似物，作为DNA合成的前体物，能相当特异地取代胸腺嘧啶核苷掺入到细胞核DNA链上。

因此，可用125I-UdR标记体外传代培养的肿瘤细胞作为靶细胞，以外周血分离的单个核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞，进行体外NK细胞活性检测。被效应细胞杀伤的靶细胞溶解后可释放125 I-UdR，用γ-计数仪测定其放射性强度，以125I-UdR释放百分率表示NK细胞的活性。

试剂及材料

1. 125I-UdR ：125I的物理半寿期为59.7d。

2. 胰蛋白酶：用无Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml，小量分装，-20℃冻存。

3. DNA酶：用Hanks液配成50μg/ml，小量分装，-20℃冻存。

4. 5-氟脱氧尿嘧啶核苷（5-FudR）用生理盐水配制成1×10-3 mol/L，4℃冰箱保存。

5. 其余材料同上。

操作方法

1. 靶细胞的制备：取培养24～48h的靶细胞1ml（5×105 /ml），分别加入5-FudR 4～6μl和125I-UdR 6μCi，混匀，置37℃培养2h，取出后用含5%NCS的1640营养液洗涤3次，每次离心1500r/min，2min，最后用完全RPMI-1640培养液悬浮，计数活细胞。用γ-计数仪检测标记率，一般可达1～2cpm/细胞即可；

2. 效应细胞的制备：用常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，最后用完全RPMI-1640培养液悬浮并计数；

3. 效-靶细胞作用：调整效应细胞和标记的靶细胞浓度，分别加入塑料试管中，效/靶细胞比例为100:1。同时设只加标记靶细胞的自然释放对照管，每份标本和对照管均设3个复管，每管均用完全RPMI-1640培养液补足体积至1ml，混匀，离心1500r/min，2min，以促进效-靶细胞作用，置37℃，5%CO2温箱中培养18h。

4. 酶处理：取出效/靶细胞培养物，1500r/min离心2min，弃上清，于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml，混匀后置37℃水浴30min，促使已受损伤的靶细胞释放125I-UdR，然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液，以终止酶反应。1500r/min离心2min，分别吸出各管上清0.5ml置于另一个塑料试管中。

5. 放射性测量和结果计算：用γ-计数仪分别测量每管上清和细胞部分的cpm值，并按下式计算125I-UdR释放率和NK细胞活性，取三管均值作为NK细胞活性。

125 I-UdR释放率（%）= （0.5ml上清cpm值×2）/（0.5ml上清cpm值+0.5ml细胞悬液cpm值）×100％

NK细胞活性（%） =试验管125 I-UdR释放率 - 对照管125 I-UdR自然释放率。

一般要求125I-UdR自然释放率<10％，检测小鼠脾细胞NK活性用YAC-1细胞作为靶细胞时，检测前可不经过酶处理。