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乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性

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乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性
 
【基本原理】
    乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一,在正常情况下,不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时,细胞膜通透性改变,LDH可释放至介质中.释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中,使氧化型辅酶I(NAD+ )变成还原型辅酶I(NADH2 ),后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲  类化合物,在490nm或570nm波长处有一高吸收峰,利用读取的OD值,经过计算即可得知NK细胞活性。
【试剂及材料】
(1)         LDH底物溶液(临用前配制):硝基氯化四氮唑蓝(NBT)4mg,氧化型辅酶I 10mg,吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)1mg,加蒸馏水2ml溶解,混匀后取上液1.6ml加1 mol/L乳酸钠0.4ml,然后加入0.1mol/L pH 7.4 PB至10ml。
(2)         1%NP-40:用RPMI-1640培养液配制。
(3)         1 mol/L柠檬酸终止液
【操作方法】
(1)         靶细胞制备:取培养24~48h的靶细胞,洗涤3次,最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 /ml,备用;
(2)         效应细胞的制备:常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞,洗涤3次,最后用完全1640营养液调整细胞浓度至1×107 /ml;
(3)         效-靶细胞作用:将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入40孔细胞培养板的孔,每份标本设3复孔,同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1ml1%NP-40液),低速离心1000r/min,2min后,置37℃、5%CO2 温箱中孵育2h;
(4)         酶促反应:取出培养物,吸取各孔上清0.1ml于另一培养板孔中,置37℃预温10min,每孔加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,室温避光反应10~15min.每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl,以终止酶促反应;
【结果分析】
    结果计算:用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值,并计算NK细胞活性。
                               实验组OD值-自然释放对照组OD值
    NK细胞活性(%)= ─────────────────── × 100%
                          最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值
【注意事项】
(1)         无论采用何种试验方法,靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率<10%。
(2)         吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细胞。
(3)         进行同位素释放试验时,各管(孔)加入的靶细胞不能太少,且靶细胞的同位素标记率也不能太低,否则会增加实验误差。
(4)         用同位素标记靶细胞时,每次实验应根据51 Cr或125 I-UdR的半寿期适当调整需要的同位素用量。此外,应用同位素释放法时,应注意实验防护和环境污染等问题。
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