乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性
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乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性
【基本原理】
乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中.释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I（NAD+ ）变成还原型辅酶I（NADH2 ），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑蓝（NBT）形成有色的甲 类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得知NK细胞活性。
【试剂及材料】
（1） LDH底物溶液（临用前配制）:硝基氯化四氮唑蓝（NBT）4mg，氧化型辅酶I 10mg，吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）1mg，加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上液1.6ml加1 mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/L pH 7.4 PB至10ml。
（2） 1％NP-40:用RPMI-1640培养液配制。
（3） 1 mol/L柠檬酸终止液
【操作方法】
（1） 靶细胞制备:取培养24～48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 /ml，备用；
（2） 效应细胞的制备：常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用完全1640营养液调整细胞浓度至1×107 /ml；
（3） 效-靶细胞作用:将效应细胞和靶细胞各0.1ml（E/T=100:1）加入40孔细胞培养板的孔，每份标本设3复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组（0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液），低速离心1000r/min，2min后，置37℃、5％CO2 温箱中孵育2h；
（4） 酶促反应:取出培养物，吸取各孔上清0.1ml于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的底物溶液0.1ml，室温避光反应10～15min.每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应；
【结果分析】
结果计算：用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。
实验组OD值-自然释放对照组OD值
NK细胞活性（％）= ─────────────────── × 100％
最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值
【注意事项】
（1） 无论采用何种试验方法，靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率<10％。
（2） 吸取细胞培养上清时，应尽可能不吸动沉淀的细胞。
（3） 进行同位素释放试验时，各管（孔）加入的靶细胞不能太少，且靶细胞的同位素标记率也不能太低，否则会增加实验误差。
（4） 用同位素标记靶细胞时，每次实验应根据51 Cr或125 I-UdR的半寿期适当调整需要的同位素用量。此外，应用同位素释放法时，应注意实验防护和环境污染等问题。
