51Cr释放试验测定NK细胞活性

基本原理

Na251CrO4能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr，即可计算出NK细胞活性。

试剂及材料

1. 铬酸钠（Na251CrO4）：51Cr的物理半寿期为27.72d。

2. 十二烷基硫酸钠（SDS）：用无菌生理盐水配制成2%浓度。

3. 靶细胞：检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代细胞株K562。检测小鼠NK细胞活性常用的靶细胞是YAC-1细胞株。实验时一般采用24～48h培养的靶细胞。

4. 效应细胞：从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核细胞或小鼠脾细胞。

5. 含15%NCS的RPMI-1640营养液及淋巴细胞分层液等。

操作方法

1. 靶细胞的制备：取培养24～48h的靶细胞2×106/0.5ml，加入100～200μci51Cr，置37℃水浴90min，每间隔15min振摇一次。然后用含5%NCS的RPMI-1640培养液洗涤三次，除去游离的51Cr。计数活细胞，用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml，如暂时不用，可放置4℃冰箱内保存。同时应检测细胞的51Cr标记率，一般要求标记率>0.1cpm/细胞；

2. 效应细胞的制备：常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，用完全RPMI-1640培养液配制成1×107/ml的细胞悬液备用；

3. 效―靶细胞作用：在无菌操作条件下，取效应细胞和靶细胞各0.1ml（E/T=100:1），加入96孔培养板内，每份标本做3复孔。同时设自然释放对照孔（0.1ml靶细胞+0.1ml完全RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1ml 靶细胞+0.1ml 2%SDS），放置37℃、5%CO2温箱内孵育4h，取出后用微量移液器吸出各孔上清0.1ml，加于小塑料试管内（勿将细胞吸出），用γ计数仪测量cpm值；

4. 结果计算:根据下式计算51Cr自然释放率和NK细胞活性:

自然释放对照孔cpm均值

最大释放对照孔cpm均值

试验孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值

最大释放对照孔cpm均值

注：一般要求51Cr自然释放率<10％