原理
材料与仪器
125I-UdR(125I-2′脱氧尿嘧啶核苷) 胰蛋白酶 DNA酶 5-氟脱氧尿嘧啶核苷 RPMI-1640培养液
塑料试管 γ-计数仪 离心机
步骤
1. 125I-UdR :125I的物理半寿期为59.7d。
2. 胰蛋白酶:用无Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml,小量分装,-20℃冻存。
3. DNA酶:用Hanks液配成50μg/ml,小量分装,-20℃冻存。
4. 5-氟脱氧尿嘧啶核苷(5-FudR)用生理盐水配制成1×10-3 mol/L,4℃冰箱保存。
5. 其余材料同上。
二、操作方法
1. 靶细胞的制备:取培养24~48h的靶细胞1ml(5×105 /ml),分别加入5-FudR 4~6μl和125I-UdR 6μCi,混匀,置37℃培养2h,取出后用含5%NCS的1640营养液洗涤3次,每次离心1500r/min,2min,最后用完全RPMI-1640培养液悬浮,计数活细胞。用γ-计数仪检测标记率,一般可达1~2cpm/细胞即可;
2. 效应细胞的制备:用常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞,最后用完全RPMI-1640培养液悬浮并计数;
3. 效-靶细胞作用:调整效应细胞和标记的靶细胞浓度,分别加入塑料试管中,效/靶细胞比例为100:1。同时设只加标记靶细胞的自然释放对照管,每份标本和对照管均设3个复管,每管均用完全RPMI-1640培养液补足体积至1ml,混匀,离心1500r/min,2min,以促进效-靶细胞作用,置37℃,5%CO2温箱中培养18h。
4. 酶处理:取出效/靶细胞培养物,1500r/min离心2min,弃上清,于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml,混匀后置37℃水浴30min,促使已受损伤的靶细胞释放125I-UdR,然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液,以终止酶反应。1500r/min离心2min,分别吸出各管上清0.5ml置于另一个塑料试管中。
5. 放射性测量和结果计算:用γ-计数仪分别测量每管上清和细胞部分的cpm值,并按下式计算125I-UdR释放率和NK细胞活性,取三管均值作为NK细胞活性。
125 I-UdR释放率(%)= (0.5ml上清cpm值×2)/(0.5ml上清cpm值+0.5ml细胞悬液cpm值)×100%
NK细胞活性(%) =试验管125 I-UdR释放率 - 对照管125 I-UdR自然释放率。
一般要求125I-UdR自然释放率<10%,检测小鼠脾细胞NK活性用YAC-1细胞作为靶细胞时,检测前可不经过酶处理。
注意事项
1. 该标记法需要长时间的孵育,用酶处理可增加方法的敏感性。
2. 要获得较理想的结果,关键在于对靶细胞标记前的代传处理。使细胞处于对数增长期的活力最佳状态,以达到最适的标记率和增强细胞对放射性同位素毒性作用的抗力,从而降低自然释放。
3. 因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞,重新开始。
常见问题
1. NK活性计算:
同位素释放%(NK活性)=(实验组cpm一自然释放cpm)/(最大释放cpm一自然释放cpm)X100
自然释放%=(自然释放cpm/最大释放cpm)x100
此结果中列出的同位素释放%,即代表NK活性。
2. 目前常用铬酸钠(Na51cro4)及125I一脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)标记祛,两种方祛各有利弊。
51Cr优点:敏感、简便、流程短、重复性好,缺点为半衰期短、自然释放高。
125I-UdR优点:半衰期长、自然释放低、适于孵育时间较长的实验。缺点为敏感性较低、流程长。
来源:丁香实验