125I-UdR致C6胶质瘤细胞损伤的模型

一、材料：125I-UdR购自中科院北京原子能所，放化纯度>95%。脱氧腺苷（AdR）、脱氧鸟苷（GdR）、脱氧胞苷（CdR）、脱氧尿苷（UdR）均为Sigma公司产品。

二、方法
1、细胞培养：当癌细胞贴壁生长超过瓶壁的70%，用胰蛋白酶消化30-40s，传代培养。肿瘤细胞每3-4d传代1次。在50ml培养瓶中，细胞数达2×106个细胞后，取处于对数生长期的细胞进行细胞存活实验。

2、细胞存活实验：将制备好的细胞按1×105个/ml细胞接种于25ml的培养瓶中，培养20小时，实验组加入125I-UdR74KBq/ml及不同浓度的AUCG（10μM、20μM、30μM、50μM、80μM）再共同孵育24h后，100倍的倒置显微镜下观察细胞形态，收集细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度，接种于25ml的培养瓶中，2-3d后换液，8-9d后细胞集落形成，每个剂量点设复瓶4瓶，同时设对照组未加AUCG，另设空白组，均为4个复瓶。计算细胞存活分数，绘制细胞存活曲线。

三、检测方法
1、采用TEM技术观察凋亡细胞超微结构：上述细胞用3%戊二醛固定后，PBS漂洗，1%锇酸固定1h，经包埋处理，超薄切片，在透射电镜（TEM）下观察细胞超微结构。

2、琼脂糖凝胶电泳成像：收集加入125I-UdR74KBq/ml+AUCG30μM后培养24h的C6细胞2×105个，2500rpm离心5min，去上清，加入裂解液，重悬细胞后，再加蛋白酶K消化30min，用等体积的平衡酚抽提两次，加入2倍体积的冰乙醇置-20℃2h，离心去上清，以75%的冰乙醇洗涤两次后，加双蒸水溶解DNA，取8μl DNA溶液及上样缓冲液2μl上样稀释，用1.5%的琼脂糖凝胶，电泳40min，将凝胶板在紫外光下，观察照相。

3、流式细胞分析

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