细胞毒性 T 细胞功能测定

细胞毒性 T 细胞功能测定的基本原理是细胞毒性 T 细胞（CTL）是特异性细胞免疫的主要效应细胞之一，一般指 CD8＋T 细胞，可特异而高效地杀伤靶细胞，参与抗病毒免疫、抗肿瘤免疫和移植排斥反应。它对靶细胞的杀伤首先基于对靶细胞表面特异性抗原的识别，CTL 可以通过其 TCR 识别靶细胞表面的抗原肽-MHC 复合物，其中抗原肽可来自肿瘤抗原、病毒抗原或自身抗原。

识别后，CTL 通过脱颗粒和直接接触杀伤靶细胞，外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性 CTL 克隆，在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后，能识别该抗原的 T 细胞克隆被选择性激活、增殖，而其他 T 细胞克隆则逐渐死亡；经 3-4 次刺激后，存活的细胞为识别 MHC-特异性抗原肽复合物的细胞即抗原特异性 CTL。细胞毒性 T 细胞对靶细胞杀伤的机制是通过释放的穿孔素-颗粒酶系统介导的溶靶细胞作用或通过 Fas/FasL 系统介导的细胞凋亡作用。

器材：离心机、细胞培养板孔板、计数板。

试剂：

① 同种抗原特异性 CTL 的诱导和制备: 丝裂霉素、IL-2、淋巴细胞;

② 病毒抗原特异性 CTL 的诱导和制备：无血清 RPMI 1640、新生牛血清、丝裂霉素 C、EBV 转化的 B 淋巴母细胞、IL-2 ;

③ 抗原肽特异性 CTL 的诱导和制备：丝裂霉素 C、IL-2。

④ 抗 TCR 介导的 CTL 活性酯酶分析法：pH7.2-7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）、抗 TCR 单克隆抗体（用 PBS 配成 5 μg/ml）、BLT 底物溶液：临用前配制，500μul 20 mmol/L N-α-苯氧羰基-L-赖氨酸硫代苯甲酯（BLT）贮存液，500μl 22 mmol/L 的 5,5＇二硫对硝基苯甲酸（DTNB）贮存液，500μl 1％TritonX-100,48.5 ml PBS。其中 各成分的最终浓度分别是：（BLT 0.20 mmol/L；DTNB0.22 mmol/L 和 TritonX-100 为 0.01％），0.1mol/L 苯甲烷磺酰氟化物（phenymethanesulfonyfluorid，PMSF）的二甲亚砜溶液。

⑤ 佛波酯和钙离子载体诱导的 CTL 颗粒酶释放分析法：1 mg/ml 十四酰佛波乙酸酯（Phorbol myristate acetate，PMA）二甲亚砜溶液；1 mg/ml 钙离子载体 A23187 的二甲亚砜溶液。配制上述两种试剂时应注意其毒性和致癌性。

⑥ 靶细胞诱导的 CTL 细胞颗粒酶胞泌作用：特异性靶细胞，其表面表达 CTL 所识别的抗原肽-MHC 复合物；pH7.2-7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）、抗 TCR 单克隆抗体（用 PBS 配成 5 μg/ml）、BLT 底物溶液：临用前配制，500μul 20 mmol/L N-α-苯氧羰基-L-赖氨酸硫代苯甲酯（BLT）贮存液，500μl 22 mmol/L 的 5,5＇二硫对硝基苯甲酸（DTNB）贮存液，500μl 1％TritonX-100,48.5 ml PBS。其中 各成分的最终浓度分别是：（BLT 0.20 mmol/L；DTNB0.22 mmol/L 和 TritonX-100 为 0.01％），0.1mol/L 苯甲烷磺酰氟化物（phenymethanesulfonyfluorid，PMSF）的二甲亚砜溶液。

（3）细胞培养液：IMDM 培养液。

（4）1mCi/ml3 H-胸苷（TdR）。

（5）半自动微孔板细胞收获机。

细胞毒性 T 细胞功能（特异性 CTL 的诱导方法以及特异性 CTL 的功能检测）的基本过程可分为如下几步:

（一）效应细胞诱导和制备-简介

效应细胞-特异性 CTL 诱导的基本方法是 T 细胞与刺激细胞共培养。由于 CTL 识别的配体是特异性的抗原肽-MHC 复合物，根据靶细胞（或刺激细胞）表达抗原肽-MHC 复合物的差异，CTL 的特异性可以表现在不同的层次上。用 MHC 型别不同的同种异体细胞作为刺激细胞能够诱导产生同种抗原特异性 CTL；用表达相应抗原的自身/同系细胞作为刺激细胞能够诱导产生抗原特异性 CTL；而将抗原肽加载到单一 MHC 分子上，例如将特定抗原肽加载到人 T2 细胞或小鼠 RAM-S 细胞上，作为刺激细胞能够诱导产生抗原肽特异性 CTL。前二者 CTL 的特异性并非针对单一的 T 细胞识别表位（即抗原肽-MHC 复合物），可用于 T 细胞功能（例如增殖和细胞毒效应）的研究；后者 CTL 是针对单一 T 细胞识别表位，除用于 T 细胞功能研究之外，还可用于 T 细胞识别机制的研究。同种抗原特异性 CTL 频率较高，一般不需体内诱导，直接在体外经混合淋巴细胞培养就可以得到；而用自身/同系细胞作为刺激细胞时，特异性 CTL 频率较同种特异性 CTL 低，为了有效获得，可以先经体内致敏，然后再经体外刺激而得到。主要包括: 同种抗原特异性 CTL 的诱导和制备、病毒抗原特异性 CTL 的诱导和制备、抗原肽特异性 CTL 的诱导和制备。以下分别介绍方法:

（一）效应细胞诱导和制备-同种抗原特异性 CTL 的诱导和制备

在单向 MLC 中，刺激细胞与效应细胞的比例为 1:20-3:1。1 周后，更换一半培养基，加入刺激细胞进行再次刺激。再次刺激后第 2 天，加入 10-30U／ml IL-2。每 3 天半量换液一次，保持 IL-2 的浓度。共刺激 2-3 次。最后一次刺激后 1 周，收集效应细胞，即同种抗原特异性 CTL，可用于特异性的杀伤实验（靶细胞为与刺激细胞来源相同的细胞，例如同一个体或同系个体的细胞）。

（一）效应细胞诱导和制备-病毒抗原特异性 CTL 的诱导和制备 (诱导 EB 病毒特异性 CTL 示例)

A. 效应细胞 取外周血分离 PBMC 或小鼠脾淋巴细胞，无血清 RPMI 1640 洗两遍，用含 20％ 的新生牛血清的 RPMI 1640 调成 1.5x10⁶/ml，置于 24 孔板中，于 5％CO₂ 培养箱中 4 小时使单核细胞贴壁以去除之，然后收集细胞，计数。

B. 刺激细胞 取 EB 病毒转化的 B 淋巴母细胞（与效应细胞来源同一个体），用γ射线照射或加入丝裂霉素 C 灭活。60Co 照射 3000rad 或者用最终浓度为 30 μg/ml 丝裂霉素 C，于 37℃ 水浴中作用 30 分钟，1000 r/min 离心 10 分钟，弃上清，细胞用 RPMI 1640 液洗涤 3 次并计数。

C. 刺激细胞-效应细胞共培养 取 2x10⁶ 已除去单核细胞的淋巴细胞加入 24 孔板中，加入经丝裂霉素 C 处理的自身（与效应细胞同一个体来源）EBV 转化的 B 淋巴母细胞 5x10⁴ 作为刺激细胞（刺激细胞的量可以调整），混匀，用完全培养基（RPMI1640）补总体积至 2 ml。

D. 静置于培养箱中，4 天后半量换液，继续培养 3 天。

E. 再次刺激 离心收集细胞，取 1x106 个效应细胞，加入 2x10⁵ 个（刺激细胞量可调整）的刺激细胞，加入终浓度为 30U/ml 的重组 IL-2；每三天半量换液一次并维持相同 IL-2 浓度。每周按相同程序刺激效应细胞一次，刺激 3-4 次后，效应细胞即为特异性 CTL，可用于细胞毒实验。

（一）效应细胞诱导和制备-抗原肽特异性 CTL 的诱导和制备

A．将分离的人 PBMC 或小鼠脾淋巴细胞铺于 24 孔细胞培养板（2x10⁶/孔-4x10⁶ /孔）。

B．选用以下几种比较常用的方法制备刺激细胞:

（1）用抗原肽直接刺激，即用加入抗原肽的方法将样本中 PC 表面 MHC 原先结合的抗原肽置换出来。加入与人 PBMC 或鼠脾细胞的 MHC 型别限制的抗原肽 5-10 μg/ml，轻轻混匀，37℃、5％CO₂ 继续培养。1 周后，采用同样的方法进行再次刺激。以后每间隔 1 周重复刺激 1 次。

（2）用抗原肽孵育后 DC 刺激，将 40 μg/ml 抗原肽加入人自身 DC 或同系小鼠的 DC，使 DC 与自身 PBMC 或鼠脾淋巴细胞的数量比为 1:1 到 1:20。混匀后，37℃、5％CO₂ 继续培养。以后每周重复刺激 1 次。

（3）用抗原肽孵育 TAP 缺陷细胞，先用与人 PBMC 或鼠脾细胞型别一致的 TAP 缺陷细胞（人 T2 细胞仅表达 HLA-A2，鼠 RAM-S 细胞仅表达 H-2Kb，且均为 TAP 缺陷细胞）与其限制性抗原肽（终浓度 40 μg/ml）于 37℃ 孵育 3-4 小时，离心洗涤并经γ射线照射或丝裂霉素 C 处理，使 TAP 缺陷细胞与 PBMC 的数量比为 1:1 到 1:20；混匀后，37℃、5％CO₂ 继续培养。以后每周重复刺激 1 次，共刺激 3-4 次。

C. 每次刺激后第 2 天，加入 10-50IU/ml 重组 IL-2（IL-2）。每 3-4 天更换一半培养基，保持 IL-2 浓度不变。最后一次刺激后第 3-5 天，收集细胞，即抗原肽特异性 CTL。用含血清的培养基重悬细胞，用于 CTL 活性的检测。

（二）靶细胞的制备

特异性 CTL 的靶细胞即 CTL 可以识别的细胞，该细胞表面必须有 TCR 识别的抗原肽-MHC 复合物。对于上述同种特异性 CTL，其靶细胞就是诱导特异性 CTL 产生的刺激细胞，或者来源于同一个体或同系个体的细胞；病毒抗原特异性 CTL 的靶细胞则是表面带有相应病毒抗原肽-MHC 复合物的自身/同系细胞（如上述 EBV 转化的 B 淋巴母细胞等）；而抗原肽特异性 CTL 的靶细胞则是表面表达与刺激细胞相同的抗原肽-MHC 复合物（如加载抗原肽的 TAP 缺陷细胞，或者具有相同 MHC I 类分子型别的病毒感染细胞和肿瘤细胞等）。

（三）特异性抗原诱导的细胞毒性 T 细胞功能测定

本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性 CTL，然后再进行细胞毒实验。对 CTL 颗粒酶的胞泌作用分析可反映细胞毒性 T 细胞功能。另外，DNA 断裂实验也可用来检测细胞毒性 T 细胞的功能。下面介绍几种 CTL 颗粒酶的胞泌作用分析方法和 DNA 断裂实验。

（三）特异性抗原诱导的细胞毒性 T 细胞功能测定-抗 TCR 介导的 CTL 活性酯酶分析法

A. 将抗 TCR 单克隆抗体 50μl（5 μg/ml，抗体刺激孔）或缓冲液 50μl（未处理或背景孔）加入 96 孔细胞培养板，室温放置 30 分钟以上，以使抗体致敏。

B. 弃去孔中液体，并用 50-100μl 完全 RPMI1640 培养液洗孔，弃去孔中的全部液体，加入 50μlCTL（10⁵ 个），补加入 50μl 完全培养液；并设颗粒酶总释放对照孔（50μl CTL＋40μl 完全培养液＋10μl 1％TritonX-100）和背景孔（50μl CTL＋50μl 完全培养液），各孔最终体积为 100μl；均设三复孔。

C. 于 37℃、5％CO₂ 温箱培养 4 小时。

D. 将培养板置吊篮上，4℃、1100 r/min 离心 5 分钟，吸取 50μl 培养上清液转入 12 mm x 75 mm 试管中，加入 950μl 新鲜配制的 BLT 底物应用液，37℃ 水浴 20 分钟。

E. 将上述处理的试管一起置冰浴中，并立即加入 0.1mol/L 的 PMSF 10μl，补加 1.0 ml PBS 使终浓度达 0.05mol/L（PMSF 是一种不可逆的丝氨酸酯酶抑制剂）。

F. 于分光光度计上测定 412nm 波长下的吸光值，并按下式计算抗体诱导的颗粒酯酶分泌百分率。

G. 结果计算: 颗粒酯酶分泌百分率（％）＝100x(E-B)/(T-B)。

式中「E」为抗体刺激的 CTL 细胞上清液平均吸光值。「B」表示背景或未处理的 CTL 细胞孔平均吸光值。「T」表示酶总释放量（即用 Triton X-100 处理的 CTL 细胞上清）。其中代表酶自发释放的 B 值一般应该是 T 值的 5％-10％ 以下。

（三）特异性抗原诱导的细胞毒性 T 细胞功能测定-佛波酯和钙离子载体诱导的 CTL 颗粒酶释放分析法

用佛波酯（phorbol esters）和钙离子载体处理 CTL，通过一种 TCR 复合物非依赖性机制，刺激 CTL 细胞颗粒酶的胞泌作用。

A. 用完全 RPMI 1640 培养液分别稀释上述两种溶液，使 PMA 为 40 ng/ml 和钙离子载体溶液为 2 μg/ml。

B. 取无菌 96 孔细胞培养板，每孔加入 2x10⁶/mlCTL 悬液 50 ml，然后加入 25μl 40ng/ml PMA 和 25μl 2 μg/ml 的钙离子载体溶液（两液的最终浓度 PMA 为 10 ng／ml 和钙离子载体为 0.5 μg/ml）并设颗粒酶总释放对照孔（50μl CTL＋40μl 完全培养液＋10μl 1％TritonX-100）和背景孔（50μl CTL＋50μl 完全培养液），各孔最终体积为 100μl；均设三复孔。

C. 将培养板置 5％CO₂ 温箱，37℃ 温育 4 小时。

D. 收集培养上清液按 TCR 单抗诱导法测定和计算酶分泌量。

（三）特异性抗原诱导的细胞毒性 T 细胞功能测定-靶细胞诱导的 CTL 细胞颗粒酶胞泌作用

该法通过抗原（靶细胞）刺激 CTL 的 TCR，从而活化 CTL 并使其脱颗粒（颗粒酶胞泌作用）。其特点是，可定量测定 CTL-靶细胞特异性的相互作用。

A. 于 96 孔细胞培养板中加入 50μl 完全培养液配制的 2x10⁶/ml CTL 悬液，然后加 50μl 2x10⁵ 靶细胞悬液，作为实验孔；并设颗粒酶总释放对照孔（50μl CTL＋40μl 靶细胞＋10μl 1％Triton X-100）和背景孔（50μl 靶细胞＋50μl 完全培养液），各孔最终体积为 100μl；均设三复孔。

B. 培养板置 37℃ 温育 4 小时。

C. 颗粒酶分析过程按抗 TCR 介导的 CTL 活性酯酶分析法。

（三）特异性抗原诱导的细胞毒性 T 细胞功能测定- DNA 断裂实验

A. 准备靶细胞: 如果用肿瘤细胞作为靶细胞: 在实验前一天把肿瘤细胞调整到 1x10⁵/ml-2x10⁵/ml。如果用脾细胞作为靶细胞: 在实验前 2 天按下述方法用丝裂原刺激脾细胞。如要刺激 T 细胞，取 2.5x10⁷ 脾细胞在 10 ml 培养瓶中，加 2.5 μg/ml Con A；如要刺激 B 细胞，取 3.0x10⁷ 脾细胞在 30 ml 培养瓶中，加 50 μg/ml LPS。不论是刺激 T 或 B 细胞，要把细胞培养到指数增长期，然后再用标记物进行标记。

B. 标记靶细胞: 加 3 H-胸苷 5μl Ci/ml 到已经丝裂原刺激过的靶细胞（脾细胞）中共培养 4-6 小时或过夜，使 3 H-胸苷进入靶细胞的 DNA 中。对于肿瘤细胞一般共培养 2-3 小时。最后可以使靶细胞的标记量为:3 H-胸苷 10 000 - 50 000 cpm/1x10⁴ 细胞。

C. 收获标记的靶细胞:400 g，7 分钟洗涤 2 次。调整细胞在 1x10⁵/ml。标记细胞要求 100％ 的活性。一般通过 Ficoll 把死细胞离心除去。对于 ConA 刺激的细胞，把 10 ml 细胞悬液放在 15 ml 离心管中；对于 LPS 刺激的细胞，把 30 ml 细胞悬液放在 50 ml 离心管中。两个离心管分别用 2 ml 和 5 ml Ficol 分离液（密度 1.077 g/ml）垫底。然后 20 分钟，800 g 室温下离心。取细胞悬液和分离液之间的细胞层，用培养液洗涤细胞 2 次，400 g，7 分钟室温下离心收获细胞，用 5 ml 培养液重悬，锥虫蓝染色活细胞计数，调整细胞到 1x10⁵/ml。

D. 制备效应细胞: 同前。

E. 检测细胞毒作用:96 孔板，在每孔加 100μl 靶细胞和 100μl 效应细胞，设 3 个复孔并设立对照组。E:T 为 100:1。肿瘤细胞自然释放值一般小于＜5％。丝裂原刺激的靶细胞自然释放值可能超过 30％（一般使用前在室温下离心洗涤 30 分钟可以降低自然释放）。室温下 400 g 离心 2 分钟，培养 3.5 小时（一般培养时间低于 51Cr 释放法）。其余同 51Cr 释放法。

F. 收集细胞: 通过半自动微孔板细胞收获机收获细胞。

注意事项: 注意通过滤器前不能使培养板结冰。

G. 测定 CTL 活性，用下列公式计算: 自发裂解率％＝［(T-S)/T］x100％

CTL 杀伤活性％＝［(S-E)/S］x100％

T: 最大裂解组；S: 自然裂解组；E: 实验组

1. CTL 作用的最显著特点是具有高度的特异性，因此，在进行 CTL 细胞毒实验时，应特别注意 CTL 识别的配体，即抗原肽-MHC 复合物的组成

2. 包被培养板的抗 TCR 抗体的量是影响活化 CTL 颗粒酶胞泌功能的重要因素，因此应预先将 TCR 单抗作一系列稀释后包被培养板，以选择最大应答的最适抗体浓度。在抗 TCR 包板之前先用 50μl 的羊（或兔）抗鼠 Ig（20 μg/ml）包板，洗后再加抗 TCR，可以提高某些对培养板结合力较低的抗 TCR 单抗在板上的表面密度。

3. 联合应用上述诱导颗粒酶胞泌作用的方法，更能客观地反映 CTL 的功能活性。在实验中应设立各种对照，以便获得正确的结果。

4. 在各种方法中，细胞悬液必须在 2 小时内与板上包被的抗体结合。经 4 小时培养后，酶分析过程（板的离心、上清液收集等）应在 1 小时内完成；收集的培养上清液（除 LDH 活性检测外）可置-20℃ 冻存备检。酶活性的检测应在 1 小时内完成。