特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定

一、基本原理

本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL，然后再进行细胞毒试验。其原理为：外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性CTL克隆，在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后，能识别该抗原的T细胞克隆被选择性激活、增殖，而其他T细胞克隆则逐渐死亡；经3~4次刺激后，存活的均为识别特异性MHC/抗原肽复合物的细胞，即抗原特异性CTL 。

二、试剂及材料

1. 丝裂霉素C（Sigma）：用培养液或PBS配制300μg/ml。

2. 含20%的新生牛血清的RPMI 1640

3. EB病毒转化的B淋巴母细胞株

三、操作方法

1. 特异性CTL的诱导和制备

① 取作者外周血分离PBMC，无血清1640洗两遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640调成1.5×106 /ml，置于24孔板中，于5% CO2 培养箱中4小时使单核细胞贴壁以去除之，然后收集细胞，计数；

② 取EB病毒转化的B淋巴母细胞，加入丝裂霉素C，最终浓度为30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀细胞用1640液洗涤3次并计数；

③ 取2×106 个PBL于24孔板中，加入5×104 （2.5%）个经丝裂霉素C处理（30mg/ml、30min）的自身、同种异体（其HLA-I类型别完全不同）的EBV-LCL细胞作为刺激细胞，混匀，用完全培养基（RPMI 1640）补总体积至2ml；

④ 静置于培养箱中；4d后半量换液，继续培养3d；

⑤ 离心收集细胞，取1×106 个反应细胞，加入2×105个（20%）的刺激细胞，第三天加入重组IL-2，使终浓度为30U/ml；每三天半量换液一次并维持相同IL-2浓度。

⑥ 每周按相同程序刺激效应细胞一次，3~4次后，效应细胞即为特异性CTL，可用于杀伤实验。

2. 细胞毒试验

检测CTL细胞毒作用均可采用检测NK细胞杀伤活性的方法，仅效靶细胞比例不一样，现将LDH释放法简要叙述如下：

① 靶细胞为用作刺激细胞的自身或同种异体EBV-LCL细胞，调成1×105/ml；

② 效应细胞为上述诱导的特异性CTL，调成2.5×106/ml；

③ 各取0.1ml于96孔板中（效/靶比值为25:1）；轻轻吹打，使二者混匀；同时设靶细胞自然释放对照组（即只加靶细胞而不加效应细胞）和最大释放对照组（0.1ml靶细胞和0.1ml 1% NP-40）；

④ 1000rpm/min离心2min后，置37°C、5% CO2 培养箱中孵育4hr

⑤ 酶促显色反应：参见“NK细胞杀伤实验”