原理
材料与仪器
丝裂霉素C PBS RPMI 1640培养基
24孔培养板 离心机 培养箱
步骤
1. 特异性CTL的诱导和制备
① 取作者外周血分离PBMC,无血清1640洗两遍,用含20%的新生牛血清的RPMI 1640调成1.5×106 /ml,置于24孔板中,于5% CO2 培养箱中4小时使单核细胞贴壁以去除之,然后收集细胞,计数;
② 取EB病毒转化的B淋巴母细胞,加入丝裂霉素C,最终浓度为30μg/ml,于37℃水浴中作用30min,1000r/min离心10min,弃上清,沉淀细胞用1640液洗涤3次并计数;
③ 取2×106 个PBL于24孔板中,加入5×104 (2.5%)个经丝裂霉素C处理(30mg/ml、30min)的自身、同种异体(其HLA-I类型别完全不同)的EBV-LCL细胞作为刺激细胞,混匀,用完全培养基(RPMI 1640)补总体积至2ml;
④ 静置于培养箱中;4d后半量换液,继续培养3d;
⑤ 离心收集细胞,取1×106 个反应细胞,加入2×105个(20%)的刺激细胞,第三天加入重组IL-2,使终浓度为30U/ml;每三天半量换液一次并维持相同IL-2浓度。
⑥ 每周按相同程序刺激效应细胞一次,3~4次后,效应细胞即为特异性CTL,可用于杀伤实验。
2. 细胞毒试验
检测CTL细胞毒作用均可采用检测NK细胞杀伤活性的方法,仅效靶细胞比例不一样,现将LDH释放法简要叙述如下:
① 靶细胞为用作刺激细胞的自身或同种异体EBV-LCL细胞,调成1×105/ml;
② 效应细胞为上述诱导的特异性CTL,调成2.5×106/ml;
③ 各取0.1ml于96孔板中(效/靶比值为25:1);轻轻吹打,使二者混匀;同时设靶细胞自然释放对照组(即只加靶细胞而不加效应细胞)和最大释放对照组(0.1ml靶细胞和0.1ml 1% NP-40);
④ 1000rpm/min离心2min后,置37°C、5% CO2 培养箱中孵育4hr
⑤ 酶促显色反应:参见“NK细胞杀伤实验”。
注意事项
1.对细胞的诱导和制备中,要使得单核细胞贴壁去除,然后才开始收集细胞,防止细胞污染。
2. 设置对照组,防止产生假阳性或假阴性等结果。
3. 生物污染会导致细胞增殖功能的降低
常见问题
1. 使用冷冻细胞时,需要复苏后检测细胞的活力。
2. 培养液中加的血清,有些血清可能抑制反应。
3. 本底应小于2000rpm,阴性对照组应该大于20000rpm。
来源:丁香实验