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特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定

相关实验:特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定

最新修订时间:

原理

本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL,然后再进行细胞毒试验。其原理为:外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性CTL克隆,在体外经某一特定(或同种异体细胞)抗原刺激后,能识别该抗原的T细胞克隆被选择性激活、增殖,而其他T细胞克隆则逐渐死亡;经3~4次刺激后,存活的均为识别特异性MHC/抗原肽复合物的细胞,即抗原特异性CTL 。

材料与仪器

B淋巴母细胞株 血液样品
丝裂霉素C PBS RPMI 1640培养基
24孔培养板 离心机 培养箱

步骤

1. 特异性CTL的诱导和制备


①  取作者外周血分离PBMC,无血清1640洗两遍,用含20%的新生牛血清的RPMI 1640调成1.5×106 /ml,置于24孔板中,于5% CO2 培养箱中4小时使单核细胞贴壁以去除之,然后收集细胞,计数;


②  取EB病毒转化的B淋巴母细胞,加入丝裂霉素C,最终浓度为30μg/ml,于37℃水浴中作用30min,1000r/min离心10min,弃上清,沉淀细胞用1640液洗涤3次并计数;


③  取2×106 个PBL于24孔板中,加入5×104 (2.5%)个经丝裂霉素C处理(30mg/ml、30min)的自身、同种异体(其HLA-I类型别完全不同)的EBV-LCL细胞作为刺激细胞,混匀,用完全培养基(RPMI 1640)补总体积至2ml;


④  静置于培养箱中;4d后半量换液,继续培养3d;


⑤  离心收集细胞,取1×106 个反应细胞,加入2×105个(20%)的刺激细胞,第三天加入重组IL-2,使终浓度为30U/ml;每三天半量换液一次并维持相同IL-2浓度。


⑥  每周按相同程序刺激效应细胞一次,3~4次后,效应细胞即为特异性CTL,可用于杀伤实验。


2. 细胞毒试验


检测CTL细胞毒作用均可采用检测NK细胞杀伤活性的方法,仅效靶细胞比例不一样,现将LDH释放法简要叙述如下:


①  靶细胞为用作刺激细胞的自身或同种异体EBV-LCL细胞,调成1×105/ml;


②  效应细胞为上述诱导的特异性CTL,调成2.5×106/ml;


③  各取0.1ml于96孔板中(效/靶比值为25:1);轻轻吹打,使二者混匀;同时设靶细胞自然释放对照组(即只加靶细胞而不加效应细胞)和最大释放对照组(0.1ml靶细胞和0.1ml 1% NP-40);


④  1000rpm/min离心2min后,置37°C、5% CO2 培养箱中孵育4hr


⑤  酶促显色反应:参见“NK细胞杀伤实验”。

注意事项

1.对细胞的诱导和制备中,要使得单核细胞贴壁去除,然后才开始收集细胞,防止细胞污染。


2. 设置对照组,防止产生假阳性或假阴性等结果。


3. 生物污染会导致细胞增殖功能的降低

常见问题

1. 使用冷冻细胞时,需要复苏后检测细胞的活力。


2. 培养液中加的血清,有些血清可能抑制反应。


3. 本底应小于2000rpm,阴性对照组应该大于20000rpm。

来源:丁香实验

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