推荐 PCR 引物设计及软件使用技巧 、实用技巧、问题总结等
丁香园
1981
PCR技术简介
前言
一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。
何谓PCR
简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
PCR的要素
基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。
PCR的历史
PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 (简称 Taq polymerase), 则是于1976年从热泉 Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication)，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制 (类似PCR前两个周期反应) 的实验。 而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年，Science 将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子 (Molecule of the year)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。
影响PCR的因素
PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员Henry Erlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业”(PCR allows people to practice molecular biology without a liscence)。也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的PCR反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度 (Taq. Polymerase, primers, dNTPs, MgCl2…)，也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然DNA模板(Template) 与 引物 (Primers) 本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中，共溶剂诸如 Dimethyl sulfoxide (DSMO)、glycerol、Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也对整个反应产生若干重要的影响。
PCR的运用
PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常 (Gene mutation, deletion, and rearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估； 对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 (DNA sequencing) 及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。 也可以做DNA指纹 (Fingerprints) 比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质 (Interleukines) 及各种生长因子 (Growth factors) 基因的表现都可用PCR来进行质与量的分析。
PCR污染及解决对策
PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。
一． 污染的预防
进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
（一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：
1． PCR用水应为高压的双蒸水；
2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；
3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。
(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
二． 追踪污染源
如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。
（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。
（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。
环境污染中常见的污染源主要有：
1. 模板提取时真空抽干装置；
2. 凝胶电泳加样器；
3. 电泳装置；
4. 紫外分析仪；
5. 切胶用刀或手术刀片；
6. 离心机；
7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。
8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
三．污染处理
（一）环境污染
1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。
（二）反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；
4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5ˊ端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
（四） 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
四．其它PCR检测方法：
（一） 两步法：是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时，两对引物在同一个管中以简化步骤，减少污染。通常第一步进行20-25个循环，扩增外引物片段；第二步再进行10个循环，扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求，即内外引物的退火温度高（如68℃），在此温度下内引物不与模板退火，然后降低退火温度（至55℃）再扩增内引物片段，这样，在操作过程中，仅打开PCR反应管一次，大大减少了污染的可能性。
（二） 荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresence PCR, F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功的，它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外，还可用HEX、JOE作为报告荧光，3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。
主要有以下优点：
1.探针特异性强，假阳性率低；
2.操作快速，不需要PCR后处理；
3.定量范围宽，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)；
4.闭管操作，PCR产物污染少；
5.灵敏度高。
主要方法有：
1..荧光探针法：进行荧光PCR检测时，要求荧光探针必须完全与靶基因互补，长度以20-30个碱基为宜，必要时3′端磷酸化封闭，以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。
荧光探针5′端标记的TAMRA，在480nm激发下产生530nm的红色荧光；3′端标记的FAM，激发后产生绿色荧光。PE公司推出的TaqMan系统，即采用双荧光探针，如配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器，可进行实时（real-time）定量检测。
2．分子信标法：分子信标（molecular beacon）是一个发夹样结构的特异探针，其环状部分与靶序列互补。在室温时，分子信标的发夹紧闭，荧光淬灭。PCR扩增时，随着温度升高，发夹松开，与单链模板特异结合，发出荧光。荧光强度与模板呈正比，故可用于PCR产物的定性及定量。
总之，人类在迈入廿一世纪中即将出现若干的突破，生物医学便是其中重要的一项。在过去三、四十年耒，像PCR这样影响深远的技术实在很难找到。它的震撼, 除了众多的得奖外(包括诺贝尔奖),更在于它的可塑性、修饰性及全方位的运用。未来的生物医学领域中，它也必定继续扮演举足轻重的角色。
PCR 引物设计及软件使用技巧
张新宇，朱有康，高燕宁
（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）
摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详
细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性
引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计
中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号：
1
自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不
合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避
免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即
错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度
（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性
(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex
formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的
GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，
引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延
伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导
致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增
加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配
位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应
当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反
应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC
含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种
方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest
neighbor method) [6][7]。
6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定
性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引
物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且
降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载
体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC
2
含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产
物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条
件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数
商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在
这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以
“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、
“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件
的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”
进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、
限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源
性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中
最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、
语音提示键盘输入（ ）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见
结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会
遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列
组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚
结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模
板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结
构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒
体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、
原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate
Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
3
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功
能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列
等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新
限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），
杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引
物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游
引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search
Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）
4
等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物
(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分
为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”
主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些
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性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引
发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最
好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾
给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改
引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易
使用，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界
面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物
设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6
至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发
6
的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows
菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo
5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili 项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左
下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选
取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结
合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线
为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选
用3’端Frq 值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值
越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，
因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。
当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，
而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的
GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基
因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较
高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的
7
8
模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的
引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute
开发的“Primer 3”等（本网站 http://210.72.11.60 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该
软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据
库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。
参考文献（References）：
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和医科大学联合出版社,1991.
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hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 1989,17:
8543-8551.
前言
一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。
何谓PCR
简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
PCR的要素
基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。
PCR的历史
PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 (简称 Taq polymerase), 则是于1976年从热泉 Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication)，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制 (类似PCR前两个周期反应) 的实验。 而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年，Science 将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子 (Molecule of the year)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。
影响PCR的因素
PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员Henry Erlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业”(PCR allows people to practice molecular biology without a liscence)。也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的PCR反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度 (Taq. Polymerase, primers, dNTPs, MgCl2…)，也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然DNA模板(Template) 与 引物 (Primers) 本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中，共溶剂诸如 Dimethyl sulfoxide (DSMO)、glycerol、Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也对整个反应产生若干重要的影响。
PCR的运用
PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常 (Gene mutation, deletion, and rearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估； 对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 (DNA sequencing) 及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。 也可以做DNA指纹 (Fingerprints) 比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质 (Interleukines) 及各种生长因子 (Growth factors) 基因的表现都可用PCR来进行质与量的分析。
PCR污染及解决对策
PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。
一． 污染的预防
进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
（一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：
1． PCR用水应为高压的双蒸水；
2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；
3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。
(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
二． 追踪污染源
如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。
（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。
（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。
环境污染中常见的污染源主要有：
1. 模板提取时真空抽干装置；
2. 凝胶电泳加样器；
3. 电泳装置；
4. 紫外分析仪；
5. 切胶用刀或手术刀片；
6. 离心机；
7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。
8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
三．污染处理
（一）环境污染
1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。
（二）反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；
4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5ˊ端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
（四） 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
四．其它PCR检测方法：
（一） 两步法：是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时，两对引物在同一个管中以简化步骤，减少污染。通常第一步进行20-25个循环，扩增外引物片段；第二步再进行10个循环，扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求，即内外引物的退火温度高（如68℃），在此温度下内引物不与模板退火，然后降低退火温度（至55℃）再扩增内引物片段，这样，在操作过程中，仅打开PCR反应管一次，大大减少了污染的可能性。
（二） 荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresence PCR, F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功的，它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外，还可用HEX、JOE作为报告荧光，3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。
主要有以下优点：
1.探针特异性强，假阳性率低；
2.操作快速，不需要PCR后处理；
3.定量范围宽，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)；
4.闭管操作，PCR产物污染少；
5.灵敏度高。
主要方法有：
1..荧光探针法：进行荧光PCR检测时，要求荧光探针必须完全与靶基因互补，长度以20-30个碱基为宜，必要时3′端磷酸化封闭，以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。
荧光探针5′端标记的TAMRA，在480nm激发下产生530nm的红色荧光；3′端标记的FAM，激发后产生绿色荧光。PE公司推出的TaqMan系统，即采用双荧光探针，如配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器，可进行实时（real-time）定量检测。
2．分子信标法：分子信标（molecular beacon）是一个发夹样结构的特异探针，其环状部分与靶序列互补。在室温时，分子信标的发夹紧闭，荧光淬灭。PCR扩增时，随着温度升高，发夹松开，与单链模板特异结合，发出荧光。荧光强度与模板呈正比，故可用于PCR产物的定性及定量。
总之，人类在迈入廿一世纪中即将出现若干的突破，生物医学便是其中重要的一项。在过去三、四十年耒，像PCR这样影响深远的技术实在很难找到。它的震撼, 除了众多的得奖外(包括诺贝尔奖),更在于它的可塑性、修饰性及全方位的运用。未来的生物医学领域中，它也必定继续扮演举足轻重的角色。
PCR 引物设计及软件使用技巧
张新宇，朱有康，高燕宁
（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）
摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详
细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性
引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计
中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号：
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自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不
合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避
免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即
错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度
（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性
(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex
formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的
GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，
引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延
伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导
致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增
加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配
位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应
当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反
应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC
含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种
方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest
neighbor method) [6][7]。
6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定
性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引
物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且
降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载
体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC
2
含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产
物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条
件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数
商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在
这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以
“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、
“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件
的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”
进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、
限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源
性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中
最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、
语音提示键盘输入（ ）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见
结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会
遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列
组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚
结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模
板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结
构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒
体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、
原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate
Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
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其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功
能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列
等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新
限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），
杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引
物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游
引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search
Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）
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等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物
(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分
为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”
主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些
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性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引
发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最
好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾
给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改
引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易
使用，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界
面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物
设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6
至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发
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的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows
菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo
5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili 项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左
下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选
取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结
合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线
为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选
用3’端Frq 值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值
越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，
因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。
当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，
而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的
GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基
因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较
高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的
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模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的
引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute
开发的“Primer 3”等（本网站 http://210.72.11.60 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该
软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据
库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。
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