七、基因鉴定篇：PCR 鉴定常见问题

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由于基因表达和调控的复杂性和多样性，客户获得小鼠模型后，在大量扩繁前，应先对模型中目的基因的敲除 / 表达情况进行检测。可以通过 RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法在 RNA 水平或者蛋白水平进行基因的敲除/表达检测。检测结果确认后，再进行大量的扩繁及表型实验等。

1、PCR 假阴性（扩增条带弱或无条带）

特征：

• 样品目的条带无法扩增或条带弱。
• 阳性对照同样没有条带或条带极弱。

原因：

• 目的片段条带过大导致扩增效率低。
• 未完全重复我方扩增体系（酶、DNA 提取、程序等）。
• PCR 仪温控模块差异。

解决方式：

• 设计备用引物，尽量缩短 PCR 产物大小。
• 完全按照我们的体系来进行鉴定。
• 由于仪器、操作等环节依然存在变量，若上述处理无法改善，建议梯度测试最优退火温度。

2、PCR 假阴性（泳道弥散状、伴随核酸挂孔现象）

特征：

• 胶孔大量发光，DNA 无法脱离胶孔。
• 泳道出现弥散状抹带，通常伴随挂孔现象。

原因：

• DNA 通过碱裂解、一步法试剂盒提取，未经纯化使用，蛋白裹在核酸上，导致核酸无法跑出胶孔。
• DNA 模板附着较多杂质，影响引物的退火结合。
• 弥散的泳道通常为一些降解的核酸片段。

解决方式：

• 稀释 DNA 模板，降低杂质比例。
• 重新纯化提取 DNA 模板（乙醇纯化、离心柱纯化等）。
• 及时电泳，避免扩增产物长时间存放室温或 4℃ 冰箱。

3、PCR 假阳性（出现污染）

特征：

• 阴性对照、空白对照出现不符合预期的条带，通常会稍弱于阳性样品的主带，偶有与主带完全相同的亮度。
• 常发生于 PCR 产物小于 500bp 的反应中，产物越小，污染可能性越高。

原因：

• 样品交叉污染，包括 DNA 模板、扩增体系配置或者电泳时污染。
• 气溶胶污染，少量样品鉴定时偶发，大批量样品鉴定、或者长时间使用同一对引物鉴定时发生频率明显增高。

解决方式：

• 轻微污染时，提高退火温度、减少 3-5 循环、稀释 DNA 模板同时进行。
• 污染严重时，重新设计备用引物检测，条带不小于 500bp，同时使用上述调整体系。

4、PCR 特异性差（存在非特异性条带）

特征：

除目的条带外，存在其他特异性扩增的产物，有时非特异性产物与目的带接近，影响结果判定。

原因：

• 引物不特异；
• 酶的效率太强、退火温度偏低、退火延伸时间过长。

解决方式：

• 非特异性扩增条带较弱时，提高退火温度、减少 3-5 循环、稀释 DNA 模板同时进行，可有效抑制非特异性扩增。
• 非特异性扩增条带较强时（杂带亮度与目的带几乎一样或者更亮），重新设计 PCR 引物。

5、PCR 优势扩增

特征：

PCR 发生优势扩增，两条带的亮度不同，甚至可能有一条带完全无法扩增。

原因：

• 当一个 PCR 反应中存在超过一种产物时，不同的产物会存在竞争性扩增，导致其中一种产物的产量远大于其他产物。
• 通常小条带比大条带更容易扩增，且两条带差距越大，优势扩增现象越明显。
• 个别情况下，比如产物序列存在特殊结构，也会出现大条带优势扩增现象。

解决方式：

集萃药康鉴定方案为避免优势扩增干扰，通常两条带差距超过 300bp，会分别设计引物用于验证，避免优势扩增出现。

6、电泳条带弯曲

特征：

电泳结果出现「笑脸状条带」。

原因：

制备琼脂糖凝胶时，煮沸后部分水分蒸发，导致琼脂糖凝胶中的电泳液浓度，高于电泳槽中的电泳液浓度。此时胶孔中的 PCR 产物，中心区域迁移速率快，周围靠近电泳液的产物迁移速率慢，展现出严重的弯曲。

解决方式：

煮沸凝胶后，需要添加蒸馏水，补足蒸发的体积，需要注意缓慢添加，并同时均匀晃动，避免局部降温过快，导致凝胶冷却不均匀产生结块。