cDNA文库组标准流程七:快速鉴定、菌落PCR

 

1 ．质粒快速鉴定   

试剂：

Protoplasting buffer:

30mM Tris-HCl, pH8.0                   0.33ml/1.0M

      5mM EDTA                               0.1ml/0.5M

      50mM NaCl                              0.1ml/5.0M

      20% Sucrose                            5ml/40%

      50µg/ml RNAseI                         50ul/10mg/ml

      50µg/ml lysozyme                       50ul/10mg/ml

补水至10ml，-20℃分装保存。

 Lysis buffer:

89mM Tris-HCl, pH8.0

89mM boric acid               2ml of 5×TBE

2.5mM EDTA

2% SDS                        2ml of  10%

5% sucrose                    1.25ml of 40%

0.04% bromphenol blue         4mg

补水至10ml，-20℃分装保存。

步骤：

1．将转化后的菌液铺平板，37℃过夜培养。

2．配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶。

3．用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 µl Photoplasting Buffer。

4．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer 的96孔板中，振荡混匀。

5．用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中，每孔4 µl，用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中（细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min），并点上Marker。

6．调节电压为20V（小槽）或40V（大槽），电泳15min，使细胞充分裂解，将电压调高到200V，继续电泳1hr，照相。

7．根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

2 ．菌落 PCR

1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。

2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。

3．依次加入：

                 10xbuffer        2.5            

Mgcl₂ (25mM)        1.8

DNTP(2.5mM)        1         

T3 引物（10pmol）  1             

T7 引物（10pmol）  1        

Taq 酶            0.4     

total           25ul    

各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上

4．94℃，2min。

5．            94℃      4分钟

94℃      40秒

53.6℃    40秒      35个循环

72℃      4分钟

72℃      10分钟

4℃       24小时

6．待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

7．将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。