合作专家 | 徐颖博士
结构生物学 中国科学技术大学
原理
直接挑取菌落进行 PCR，PCR 的 95 ℃ 加热可以破胞，释放基因组 DNA 或质粒，成为 PCR 体系的模板，然后进行链式扩增。
材料与仪器
器材：PCR 仪、移液器；
试剂：菌落样品、dNTPs、Taq 聚合酶、Taq buffer（10x）、dNTPs、引物对、无菌 ddH2O。
步骤
1. PCR混合液的制备
（1）Taq buffer（10x）180 ul
（2）dNTP（2.5 mM）20~25 ul
（3）Primer Forward（引物浓度在10 Pmol） 5 ul
（4）Primer Reverse（引物浓度在10 Pmol） 5 ul
（5）ddH2O 147 ul
（6）Taq（2 U/ul）12~15 ul
2. 常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落（强调单个，不能是双克隆），在 LB 琼脂糖平板上轻点，做一拷贝。
3. 然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有 PCR 管中或者 96 空 pcr 反应板（管子做好记号，如平板上点的是 1#，则管子上也标 1#，以便筛选到克隆后的扩到培养）。
4. 挑好单克隆菌落后将之前配制好的 PCR 混合液加入体系是 30 ul。
5. 将混有菌体的 PCR 混合物置于 PCR 仪中，按常规条件扩增。
6. 将扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料，电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。
7. 将已经接种有菌落的平板置 37 ℃ 培养箱培养过夜，使菌落扩增。
8. 次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤 2 也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做 PCR 的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。
注意事项
1. 设计引物很关键。
一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如 pET 系列可用 T7 通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR 条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。
2. 使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过 25 个。同时因为扩增的片段的 GC 含量问题，有的 GC 含量很低，有的又很高，导致菌落 PCR 不容易扩增出目的条带，在此建议在设置 PCR 程序时以高 GC 的温度为上限，每一循环降 0.2 度左右。
来源：丁香实验
