酵母菌落PCR方法

问：很郁闷，最近在做电转毕赤酵母，但是转化完了没有合适的筛选方法，如果提基因组的话费时费钱，而且由于我这个电转的几率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR方法筛选，但酵母菌破壁很困难，如果处理不好的话基因组释放不出来，就没有阳性结果了。

查了一些资料说用反复冻融法，是不是直接挑单菌落就行了呢？还有说用蜗牛酶帮助消化的，这个我倒不是很清楚，所以请各位大虾们帮帮忙，现在实在是被这个伤透脑筋了！

求助十万火急！！！！！！！

答：蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定

酵母DNA的提取

1、x新鲜的菌体中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。

　　2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul

　　3、加入25ul，10%SDS。65度，30min水浴。

　　4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）

　　5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）

　　6、12000rmp，15min，弃上清。

　　7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min

　　8、将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min

　　9、加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中

　　10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

　　11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA

　　12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA

　　13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA

　　14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法

酵母菌落PCR

　　1、酵母质粒和基因组DNAPCR模版的制备

　　取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于－20度取1ul用于PCR

　　2、从平板上调取长势良好的菌落少许，悬浮于含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子因受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min

　　3、利用微波炉快速制备酵母治理以及菌落取直径大于3mm的酵母干菌落，至于EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR

真菌DNA的提取方法改良

　　1、酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌体

　　2、取少许新鲜的菌体，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。0.1ml蜗牛酶（30mg/ml），37度温浴60min

　　3、3000r/min离心10s，去上清，沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度，30min水浴。

　　4、加入0.3ml ，5mol/lKAC冰浴60分钟

　　5、10000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）在5000-6000r/min离心15s　　

　　6、沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris，1mol/l EDTA溶解1000r/min，离心15min

　　7、上清液转移一个干净的离心管中，加入6ul10ug/ul），ran酶，37度，30min

　　8、加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中

　　9、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

后续试验思路

　　1、提取酵母DNA

　　2、作PCR

　　3、筛库的引物（上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC
　　　　　　　　　下：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT
　　因为这个引物的TM值很高，所以必须使用二次PCR
　　94度，3min，95度，20miao，68度3min，68度7min，15度15min
　　修改程序94度，3min，95度，25miao，50度25miao，72度1min30s，72度5min

　　4、利用T和B酶切（65度酶切）
　　Taq I（AGCT）
　　1undefinedTaq I Basal buffer
　　0.1%bsa
　　PCR产物
　　灭菌水
　　酶
　　BsuRI(GGCC)
　　R buffer
　　模版
　　灭菌水
　　酶

　　5、分出不同的片断

　　6、将DNA转到大肠杆菌中，然后提取质粒，测序或是使用抗生素筛选AMP，得到AD，kana得到BD