PCR引物特异性不够好，又没什么好的方法来避免呢？
MikeXio
最近做反扩，原本想得到这样的一段反扩片段：
想要得到的
可是正反引物都有两个结合位点，结果就是下面这样一共扩增出来两段非常亮的条带：
胶图
实际上得到的1
求助大佬们给一些建议，换一个怎样的新方法可以把这个反扩载体得到呢？
回复点赞收藏 邀请讨论···
分享
2 个回答
黑布林的大狸子
有帮助
看不见电泳图，猜一下情况吧
1.如果电泳图上有你想要的条带，直接切取相应条带，做琼脂糖凝胶回收就好了（天根有卖），这个片段只会有你引物的两个结合位点，然后用作模板再扩增就行了。
2.如果没有目标条带，可以尝试提高退火温度，也可以考虑换引物
ps.如果题主只是想做检测的话，加条探针就好了。
jiansu123
有帮助
估计要用overlap extension的方法。第一对引物先p laci到mcherry部分，注意在上游引物设计酶切位点和保护碱基。第二对p 另外部分mcherry以及剩下序列，注意上游要有部分序列和第一对引物下游序列相同，下有部分加上酶切位点和保护碱基。然后第三对引物上游是包含第一段上游的保护碱基和酶切位点，下游包含第二段下游的保护碱基和酶切位点
提问
扫一扫
实验小助手
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序